干扰素(interferon,IFN)是公认的治疗慢性乙肝的主要药物，可通过2',5'-寡腺苷酸合成酶(2',5'-oligoadenylate synthetase,2',5'-OAS)、蛋白激酶R(protein kinase R,PKR)等途径，激活一个内源性核酸内切酶降解病毒RNA，同时蛋白激酶能灭活核糖体合成所必需的酶，从而发挥抗病毒效应^[1]，同时IFN与免疫细胞上IFN受体结合，可激活Jak-STAT途径的Jak激酶中的Jak1和Tyk2和白细胞转导与转录激活因子(STAT)中的STAT1和STAT2，诱导免疫细胞活化。白细胞分化抗原(CD)25是白细胞介素-2(interleukin-2 receptor,IL-2R)α链，是T细胞活化的标志^[2-4]，是反映宿主免疫状态的重要指标。为探讨IFN-α2b对CD25、CD25 mRNA表达水平的影响，本文选择160例典型慢性乙肝患者进行观察。现将结果报道如下。

选择2004年6月～2005年3月本院教学医院收治的住院和门诊典型慢性乙肝患者160例，其中男10³例，女57例；年龄22～56岁，平均36.5岁。对入选者均以酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测乙肝血清标志物，临床诊断参照2000年及2005年全国病毒性肝炎会议修订的诊断标准，其中慢性乙肝轻度93例(男58例，女35例；年龄22～55岁，平均36.6岁)；慢性乙肝中度67例(男45例，女22例；年龄23～56岁，平均36.3岁)；入选者均HBsAg(+)＞6个月，抗-HBc(+)，HBeAg(+)，2倍正常上限<ALT<5倍正常上限，血清胆红素升高>2倍正常值上限，所有病例无合并甲、丙、丁、戊型肝炎感染的实验室证据，无骨髓抑制者，无明显的心、脑、肾、神经、精神病和不稳定糖尿病病人，无酗酒和吸毒史，试验前1～6个月未服用过影响研究结果的药物，无核苷类药物过敏者，非妊娠和哺乳者。

淋巴细胞分离液(上海恒信化学试剂有限公司)；RPMI 1640培养基(美国Sigma公司)；CD25免疫组织化学染色法试剂盒(上海思创生化电子有限公司)；Trizol试剂盒(美国Invitrogen公司)；LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I(德国Roche公司)；EXL808全自动酶标仪和EXL-50X全自动洗板机(美国Bio-Tek公司)；Nikon E-400荧光显微镜(日本Nikon公司)；INCO₂/108型Memmert CO₂培养箱(德国Memmert公司)；iCyclez⁵荧光实时定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

将轻、中度慢性乙肝患者随机分为IFN治疗亚组和常规治疗亚组，轻度组：IFN亚组47例，男30例，女17例，年龄23～55岁，平均36.7岁；常规亚组46例，男28例，女18例，年龄22～54岁，平均36.5岁；中度组：IFN亚组34例，男22例，女12例，年龄24～54岁，平均36.4岁；常规亚组33例，男23例，女10例，年龄23～56岁，平均36.2岁。IFN亚组给予IFN-α2b(安徽安科高科技有限公司)300万国际单位治疗，肌内注射，每日1次，2周后改为隔日1次，16周为一疗程，共3个疗程；常规亚组以门冬氨酸、维生素C(VC)等一般保肝护肝药物治疗。对照组系健康献血员，其中男13例，女7例，年龄23～45岁，平均36岁。

将新鲜肝素抗凝血2ml用无Ca²⁺、Mg²⁺+的Hank's液等量稀释后，以淋巴细胞分离液常规分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)，以Hank's液洗涤2次，以RPMI 1640完全培养液配成(1～2)×10⁶/ml细胞悬液，取10 μl涂布于印有防酸漆圈的玻片孔内并自然干燥，用新鲜丙酮固定15～20 min，稍干后加入抗-CD25的单克隆抗体10 μl，放入湿盒37℃、5%CO₂环境孵育30 min，然后用Tris缓冲液(TBS)漂洗，稍干后加生物素化羊抗鼠IgG10 μl于各孔中，用TBS漂洗，最终加入当天新鲜配制的二氨基联苯胺(DAB)显色液，待显色明显时用TBS漂洗，终止显色，高倍镜下观察，行静息态CD25检测，共计数200个细胞，细胞膜呈棕色者为阳性，分别计算阳性细胞百分率。取上述分离提纯的细胞悬液0.5 ml，加入含200 μg/ml PHA的RPMI 1640完全培养液0.5 ml，置37℃、5%CO₂环境孵育72 h。取沉淀细胞用RPMI 1640完全培养液稀释至(1～2)×10⁶/ml，同法涂片、孵育、漂洗、镜检，行诱导态CD25检测。

分批采集患者空腹静脉血，参照王健等^[5]方法制备静息态与诱导态细胞悬液，行CD25 mRNA检测。方法、步骤如下：先用Trizol试剂从PBMC中抽提总RNA，逆转录成cDNA置-86℃冰备检。采用SYBR Green I荧光标记法检测PCR产物，总反应体系为25 μl，包括2 μl标准品或模板cDNA，模板cDNA以1∶4稀释。CD25引物设计参照Hirata等^[6]方法，CD25 mRNA引物：sense(5′3′)为CAAAGT CCAATG CAG CCA GT，Anti-sense(5′3′)为TCA CCT GTG CAT ATG AGC TG，扩增片段长度232 bp。以GAPDH的PCR产物为内参标准。标准品以10倍梯度稀释，取6个梯度(10⁶ copies/ml、10⁵ copies/ml、10⁴ copies/ml、10³ copies/ml、10² copies/ml和10 copies/ml)绘制标准曲线。GAPDH引物1：sense(5′3′)为AGA AGG CTG GGG CTC ATT TA，GAPDH引物2：anti-sense(5′3′)为AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC，扩增片段长度为258bp。PCR反应参数：95℃预变性300 s，95℃ 10 s，65℃ 10 s，共40个循环，最后72℃保温300 s。为减少模板cDNA浓度等其它因素对扩增效率的影响，以log cDNA/log GAPDH为其最终含量。

CD25表达水平以(x±s)表示；为克服系统误差，以CD25 log cDNA/log GAPDH的(x±s)表示CD25 mRNA表达水平，以排除RNA提取和逆转录过程中的系统误差。组间均数差异采用t检验。

表 1

表 1 IFN-α2b对慢性乙肝轻、中度患者CD25表达的影响( n , x ± s ,%))

表 1 IFN-α2b对慢性乙肝轻、中度患者CD25表达的影响( n , x ± s ,%))

随IFN疗程延长，轻、中度组CD25的表达水平逐渐增高，且高于常规组；但与正常对照组差异有统计学意义。第3疗程后，轻、中度组IFN治疗者CD25水平升高，与常规治疗者比较，差异有统计学意义(P<05)。轻、中度组以IFN-α2b治疗者，其诱导态CD25水平显著增高，与常规组比较，差异亦有统计学意义(P<05)。

表 2

表 2 IFN-α2b对慢性乙肝轻、中度患者CD25 mRNA表达的影响( log cDNA/ log GAPDH, x ± s)

表 2 IFN-α2b对慢性乙肝轻、中度患者CD25 mRNA表达的影响( log cDNA/ log GAPDH, x ± s)

随IFN疗程延长，轻、中度组患者CD25 mRNA的表达也逐渐增高，但与正常对照组仍有一定差异性；IFN治疗3个疗程后，第3疗程结束后，轻、中度组IFN治疗者CD25 mRNA表达水平与常规治疗者比较，差异有统计学意义 (P<05)。诱导态CD25 mRNA水平与其静息态水平呈平行关系。

IFN-α的作用机制包括直接抗病毒作用和免疫调节作用。IFN治疗3个疗程后，轻、中度组患者CD25水平与常规治疗者有差异性(P<.05)，提示IFN的诱导效果与患者的病情有关^{[5, 7]}，当病情处活跃期，IFN的诱导效果弱、诱导过程长，故对部分病例暂时疗效不显著者，可考虑适当延长IFN使用时间或加大IFN使用剂量以增强疗效。

CD25 mRNA是反映编码或调控CD25表达和分泌的新型指标^{[8, 9]}，通常在活化性T细胞高表达。慢性乙肝患者CD25 mRNA水平较低。IFN-α2b治疗后，慢性乙肝患者轻、中度组CD25 mRNA均同步升高，此与外周血单个核细胞CD25表达具有一定的相关性，提示IFN-α2b确可使宿主T细胞活化，促进CD25表达水平提高；CD25 mRNA能从基因转录水平更准确的反映机体T细胞活化状况。IFN-α2b诱导效果与机体的免疫状况、病情程度相关^[10]。

PBMC富含T淋巴细胞，其表面含有PHA受体。当患者PBMC与PHA共孵育后，CD25、CD25mRNA的表达水平显著升高，但其表达水平与对照组比较仍有较大差异(P<05～P<01)。提示PHA能非特异性刺激T细胞活化增殖，患者T细胞活化功能虽较正常者低，但对PHA仍有较强的免疫反应性。采用IFN-α2b治疗的患者，CD25、CD25mRNA的表达水平在静息态和诱导态均显著增高，表明IFN-α2b具有类似PHA的免疫诱导作用，确可使宿主T细胞活化，提高CD25 mRNA基因转录水平，促进CD25表达，参与抗病毒作用。

综上所述，IFN-α2b具有较强的免疫诱导能力，可使T细胞活化，促进CD25、CD25 mRNA表达增加，参与机体抗病毒作用。