中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (11): 1350-1352   PDF    
引用本文
黄晓敏, 柯野, 林良佳, 陈春营, 王晓, 李洁, 黄卓星. 溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜影响[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(11): 1350-1352.
HUANG Xiao-min, KE Ye, LIN Liang-jia, et al. Effects of rabdosiae serrae compound preparation on staphylococcus aureus biofilm[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(11): 1350-1352.
溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜影响
黄晓敏1, 柯野1, 林良佳1, 陈春营1, 王晓2, 李洁2, 黄卓星1     
1. 韶关学院英东生物工程学院, 广东韶关, 512005;
2. 湘南学院基础医学系
收稿日期: 2007-05-05
基金项目: 广东省科技计划项目(2005B33001004)
作者简介: 黄晓敏(1955- ),女,湖南郴州人,教授,本科,研究方向:细菌的药敏和耐药性机制。。
摘要： 目的 研究溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜的影响。 方法 采用试管二倍稀释法测定药物的最低抑菌浓度(MIC),用Brown平板改良法体外复制金黄色葡萄球菌生物膜模型,并检测溪黄草复方的不同MIC浓度对金黄色葡萄球菌生物膜的影响,扫描电镜确认。采用人绒毛膜单层细胞体外培养检测受试药物的毒性作用。 结果 溪黄草复方对金黄色葡萄球菌的MIC值为128 mg/ml,当MIC值增加至192和256 mg/ml作用于金黄色葡萄球菌生物膜时,其活菌数明显减少。受试药物无体外活细胞毒性作用。 结论 溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜有清除效应,无细胞毒性作用,具备开发应用的潜力,但还需进行药物配方和临床用药研究。
关键词： 溪黄草复方     金黄色葡萄球菌     生物膜     清除效应    
Effects of rabdosiae serrae compound preparation on staphylococcus aureus biofilm
HUANG Xiao-min, KE Ye, LIN Liang-jia, et al     
Yingdong College of Bicengineering, Shaoguan University, Shaoguan 512005, China
Abstract: Objective To study the effects of rabdosiae serrae compound preparation on stap hylococcus aureus biofilm. Method Minimal inhibitory coh centration(MIC)were tested by doubling dilution,and simulate S.aureus biofilm in vitro be improved Brown plate method.The effects of R.serrae compound preparation in different MICon S.aureus biofilm were determined and confirmed by scanning electronic microscope(SEM).Single layer cells of human floss film were used to test the toxic effects of the compoud preparation. Result The MIC of S.serrae compound to S.aureus was 128 mg/ml, and the MIC reached 192 mg/ml or 256 mg/ml,the viable count of S.aureus on S.aureus biorilm reduced clearly.The tested preparation had no tox ic effects against single layer cells of human floss film. Conclusion R.serrae compound preparation had eliminating effects on the biofilm formed by S.aureus,no toxic effects againsthuman cells in vitro,and a good value to be exploited.The further research of the prescription and the using in clinic was still required.
Key words: Rabdosiae serrae compound preparation     staphylococcus aureus     biofilm     eliminating effects    

溪黄草复方系广东省粤北､粤东等地区人们饮用的凉茶原料成分,能有效抑制金黄色葡萄球菌浮游菌的生长[1, 2]｡金黄色葡萄球菌是细菌生物膜(Bacterial Biofilm,BF)的主要形成菌,亦是静脉导管或其他医疗装置相关感染的主要致病菌,由于金黄色葡萄球菌生物膜的形成是由细菌分泌的多糖黏质的黏附作用而实现,所以BF一旦形成即产生较强的耐受理化因子的能力,能保护细菌不受抗菌药物的作用,并降低机体的免疫功能和巨噬细胞的吞噬作用,致使感染难以治愈[3]｡此外细菌可通过密度感应系统彼此协同,调整菌体数量共同应对外界环境的异常变化,由此导致临床上常规的抗生素治疗对BF引起的感染疗效欠佳,再加上细菌耐药因子的传播,使得传统抗生素治疗更加棘手｡因此,研究防治BF相关感染的有效药物更显重要｡本次试验主要探讨溪黄草复方在体外对金黄色葡萄球菌生物膜的影响｡

1 材料与方法 1.1 样品来源

(1)试验样品:溪黄草复方由溪黄草､田基黄､大蓟､岗梅根､梅花冰片､虎杖､枸骨叶､九节茶组成,采集于粤北地区乳源县､始兴县山区｡(2)样品配制:按戴自英提供的方法制备生药浓度为1 g/ml的水煎液[4]｡

1.2 菌株来源及其培养

(1)金黄色葡萄球菌临床分离株,来源于广东省粤北人民医院内科住院患者静脉插管黏附菌,经本学院微生物学实验室TDR-200B全自动型微生物分析仪检测鉴定证实｡按文献[5]进行生物膜定性,以确定能产生生物膜的金黄色葡萄球菌｡(2)质控菌株:金黄色葡萄球菌(S.aufeus)ATCC25923(中国药品生物制品检定所)｡(3)菌株培养:受试菌培养采用大豆胰酶肉汤(LB),LB琼脂平板｡pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)等均为本实验室配制｡

1.3 仪器

TDR-200B全自动型微生物分析仪(长沙天地人生物科技有限公司);旋涡混合器(北京同正技术发展公司);721分光光度计(上海第三分析仪器厂);麦氏比浊仪(法国bio-Merieux公司);Olympus光学显微镜,倒置显微镜(日本Olympus公司)｡日立CO2临界点干燥仪,日立HCP-2离子溅射仪,日立E-1010扫描电子显微镜(日本日立公司)｡

1.4 体外抑菌试验

采用试管二倍稀释法测定溪黄草复方对金黄色葡萄球菌的MIC同时,平行测定其对s.aureus ATCC25923的MIC,作质量控制｡测定技术依据美国临床实验标准化委员会(NCCLS)2004标准[6],溪黄草复方对金黄色葡萄球菌的MIC为128 mg/ml｡

1.5 体外BF模型的制备与显微鉴定

(1)BF模型制备:采用Brown平板法[7]并进行改良,将复苏后传代培养16 h的金黄色葡萄球菌接种于LB肉汤中37℃培养过夜,用无菌生理盐水离心洗2次,再用生理盐水重新悬浮｡用分光光度计560 nm测定其吸光度(A)值,使菌悬液的A值达0.029(相当细菌数约为1.5×106 CFU/ml)｡将此菌悬液用生理盐水稀释10倍,注入1.5cm×15 cm无菌试管内5 ml,同时加入已灭菌的制备成1.0 cm×1.0 cm的一次性输液管片(已压平),37℃培养,连续培养7 d,即可形成成熟的BF｡(2)BF模型制备的显微鉴定:从菌悬液中取出已培养7 d的BF载体,经无菌生理盐水数次漂洗去除浮游细菌,单染色,光学显微镜油镜观察可见排列紧密的葡萄球菌细菌层,弃去｡取同时培养的其他BF载体膜,用pH 7.2的0.1 mol/L PBS(4℃预冷)漂洗,在4℃环境中,以2.5%的戊二醛(为本实验室配制)固定4 h;用PBS漂洗3次,每次15 min;按50%,70%,90%,100%体积分数系数的乙醇梯度脱水,每梯度15 min,其中100%乙醇脱水3次;用醋酸异戊酯置换乙醇0.5 h;CO2临界点干燥;粘台,喷金,扫描电镜(SEM)观察确认(所用试剂均为南方医科大学电镜室配制)｡

1.6 溪黄草复方对金黄色葡萄球菌BF的影响

(1)SEM观察溪黄草复方对细菌BF的影响:根据受试菌株的MIC值(128 mg/ml)以及细菌BF对抗菌药物的耐受性大于浮游菌的原理[3],用无菌生理盐水将溪黄草复方制剂分别稀释成对受试菌MIC值的2倍(256 mg/ml),1.5倍(192 mg/ml),1倍(128 mg/ml),1/2倍(64 mg/ml)系列浓度,并设置不含药物的空白对照,各浓度药液2 ml分别加入至1.5×10 cm无菌试管内,把已形成细菌生物膜的载体从生理盐水管中取出,用无菌生理盐水漂洗后,将其放入各药液浓度试管内,37℃培养24 h｡取出生物膜载体,用无菌生理盐水冲洗,除去未黏附菌,经固定､脱水后,用SEM观察确认｡(2)溪黄草复方对金黄色葡萄球菌BF的清除效应:取连续培养7 d的细菌生物膜的载体,用PBS冲洗未附着细菌,将其放入无菌试管中,用无菌生理盐水将溪黄草复方分别稀释成对受试菌的256,192,128,64 mg/ml系列浓度,并设置不含药物的空白对照,37℃培养,分别于0,4,8,24 h将试管置旋涡混合器上以2 200 r/min震荡混合10 min,使载体表面的BF及BF内的细菌脱落到试管内形成菌悬液,再用连续稀释法进行活菌计数,每次测定均重复3次计算平均值,每个时间段计数4份标本,结果用x±s表示｡

1.7 活细胞来源及溪黄草复方毒理试验

(1)活细胞来源:试验用细胞为人绒毛膜单层细胞(湖南省郴州市妇幼儿童医院妇产科)｡(2)活细胞培养:采用5%水解乳蛋白细胞培养液(本实验室配制)｡具体方法:取停经50 d人工流产绒毛组织常规消化,置5%水解乳蛋白细胞培养液(含10%~20%小牛血清),5%~10%CO2培养箱培养3~5 d,每天观察,待形成单层细胞时,分别取用无菌生理盐水将溪黄草复方制剂分别稀释成对受试菌的256,192,128,64 mg/ml系列浓度,分别注入已形成单层人绒毛细胞的培养管内,比例为1:1,并设置不含药物的空白对照,置5%~10%CO2培养箱,37℃培养观察3~5 d,从培养后的第2 d开始用倒置显微镜观察并记录｡

1.8 统计分析

采用SPSS 10.0软件进行t检验｡各药物组内不同作用时间的细菌存活数比较用单因素方差分析｡

2 结果 2.1 扫描电镜鉴定BF形成并观察溪黄草复方对BF影响

在载体表面形成的金黄色葡萄球菌生物被膜细菌呈球状,隐约可见细菌之间的黏液丝借助其使细菌相互连接形成生物膜｡由于在载体样品处理过程中经脱水､干燥等步骤,因此可以推测生物膜中细菌之间在未经处理前充满了黏液｡溪黄草复方在128 mg/ml浓度时对金黄色葡萄球菌生物膜无明显抑制作用,但载体上的BF细菌数量有所减少｡当受试药物浓度达192和256 mg/ml时对生物膜上的金黄色葡萄球菌有较明显的清除效应,随药物浓度的加大,载体上细菌数目减少｡

2.2 药物对金黄色葡萄球菌生物膜存活细菌数影响(表 1)
表 1 培养7 d的生物膜载体经不同药物浓度溪黄草复方作用后活菌计数( × 103 CFU/ml)

当用溪黄草复方64,128 mg/ml浓度作用生物膜细菌,在4,8,24 h时BF的活菌数与生理盐水对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)｡当继续增加药物浓度至192,256 mg/ml,在4,8,24 h对BF的活菌数明显减少,与生理盐水对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),但24 h内BF中的细菌不能被完全清除｡各时间段之间活菌数差异无统计学意义(P>0.05)｡结果表明,192,256 mg/ml浓度的溪黄草复方对BF有清除效应｡

2.3 溪黄草复方药物毒理试验检测结果

从细胞培养后的第2 d开始用倒置显微镜观察至第8 d,人绒毛膜单层细胞未出现变圆､肿胀､皱缩､融合等病变现象,基本与正常细胞一致,确认溪黄草复方对细胞无明显毒性｡

3 讨论

本次试验研究显示,金黄色葡萄球菌生物膜在溪黄草复方192,256 mg/ml浓度中作用24 h时,电镜下可见载体上BF的细菌数目随着药物的浓度加大而减少,但BF细菌不能完全清除｡将培养7 d的BF载体,经溪黄草复方64,128 mg/ml药物浓度作用后的活菌计数显示:该药物剂量对BF基本无效,与文献[8]报道相符｡当溪黄草复方药物浓度增加至192,256 mg/ml作用4,8,24 h时,经活菌计数显示,3个时间段均出现活菌数减少的趋势,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),表明溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜细菌有清除效应,但BF细菌不能完全被清除｡

中草药抗菌作用一直不被重视,原因是抗菌效果远不及抗生素,而本次试验结果显示,溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜有较好的清除效应,其中有中草药复方的抗菌效果,也有因为中草药的药物成分多而杂,特别是其中可能有化痰祛湿药成分,而化痰祛湿的药物成分正是可以降低BF渗透限制性,使有效抗菌成分渗透入BF内而起到对细菌的清除效应[9],从而有效提高了溪黄草复方对金黄色葡萄球菌生物膜的药理作用｡

本次试验环境与人体内环境有一定差异,研究结果还有待于进行临床用药试验,以确定疗效｡尽管溪黄草复方对BF的有效清除效应浓度偏高,但药物毒理试验结果显示受试药物无明显毒性作用,提示溪黄草复方具有开发应用的潜力｡

致谢 韶关学院英东生物工程学院植物学教研室叶添谋博士对中草药样品的鉴定;南方医科大学电子显微镜室安连兵老师提供的电镜技术支持｡
参考文献
[1] 黄晓敏, 郑秋桦, 廖玲军, 等. 粤北山区14种中草药抗菌效能的实验研究[J]. 陕西中医, 2005, 26(9) : 963–965.
[2] 邢莹莹, 岑颖洲, 王一飞, 等. 瑶药枸骨叶不同溶剂组分体外抑菌体活性比较[J]. 暨南大学学报, 2004, 25(1) : 119–121.
[3] Costerton W, Veeh R, Shirtliff M, et al. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections[J]. J Clin Invest, 2003, 112(60) : 1463–1472.
[4] 戴自英. 临床抗菌药物学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1985: 377-378.
[5] Arcioia CR, Baldassarri L, Monianaro L. Presence of ica A and ica D genes and slime production in a collection of staphylococcal strains from catheter asscciated infactions[J]. J Clin Microbiol, 2001, 39 : 2151–2156. DOI:10.1128/JCM.39.6.2151-2156.2001
[6] National Committee Clinical Laboratory Standards.Performance standards for antimicrobial susceptiblity testing[S].NCCLS,2004:1-159.
[7] Hoiby N, Krogh J H, Moser C, et al. Pseudomonas aeruginosa and the in vitro and in vivo biofilm mode of growth[J]. Microbes Infect, 2001, 3(1) : 23–26. DOI:10.1016/S1286-4579(00)01349-6
[8] O Toole G. To build a biofilm[J]. J Bacteriol, 2003, 185(9) : 2587–2689.
[9] 蔡长清, 毛红, 王宝香, 等. 氨嗅索对氨卞西林/舒巴坦的肺部转运作用在儿科的运用[J]. 中国抗生素杂志, 2005, 30(3) : 509.