中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (11): 1346-1348   PDF    
引用本文
孙忠, 吴蕴棠, 张万起, 王夏, 刘小勇, 周壮志, 王永明. 糖尿病大鼠补锌后新基因片段表达与鉴定[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(11): 1346-1348.
SUN Zhong, WU Yun-tang, ZHANG Wan-qi, et al. Expression and identification of novel genes differentially expressed in diabetic rats supplemented with zinc[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(11): 1346-1348.
糖尿病大鼠补锌后新基因片段表达与鉴定
孙忠1, 吴蕴棠1, 张万起1, 王夏2, 刘小勇2, 周壮志2, 王永明1     
1. 天津医科大学公共卫生学院, 天津, 300070;
2. 中国科学院微生物研究所
收稿日期: 2007-04-18
基金项目: 国家自然科学基金(30471459);天津市自然科学基金(033611611)
作者简介: 孙忠(1963- ),男,天津人,副教授,硕士,主要从事营养与慢性疾病的研究。。
通讯作者: 吴蕴棠
摘要： 目的 对糖尿病大鼠补锌后出现的新基因片段进行组织表达与鉴定。 方法 对前期研究中分离到的补锌糖尿病大鼠与糖尿病对照组比较有异差的基因片段进行克隆、测序、同源性分析后,对发现的6条新基因(Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14、Zn-19、Zn-20)进行RT-PCR鉴定,以排除假阳性并观察其在各组大鼠肝脏中的表达水平。 结果 20条cDNA片段经克隆、测序、同源性分析,发现了6个基因片段(Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14、Zn-19、Zn-20),在Gen Bank中未找到高同源性的序列,为新的表达序列标签(EST)。其中4个基因片段在糖尿病对照组、糖尿病补锌组肝脏中的表达量均低于正常对照组,糖尿病补锌组的表达量高于糖尿病对照组(P<0.05)。4个新基因片段被Gen Bank收录,接收号分别为AY952968,AY952970,DQ351838,DQ351839。 结论 分离并克隆了4条与补锌有关的糖尿病大鼠差异显示的新基因片段,在GenBank上成功登录。
关键词： 糖尿病大鼠     RT-PCR     新基因     基因克隆     锌    
Expression and identification of novel genes differentially expressed in diabetic rats supplemented with zinc
SUN Zhong, WU Yun-tang, ZHANG Wan-qi, et al     
1. 中国科学院微生物研究所;
2. School of Public Health, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, China
Abstract: Objective To express and identify novel gene fragments differentially expressed from diabetic rats supplemented with zinc. Method cDNA fragments from former research project were cloned,sequenced and BLASTn analysed.The RT-PCRof the six novel genes were made to observe the expression changes in liver of various groups. Result Zn-2, Zn-6,Zn-10,Zn-14,Zn-19,and Zn-20 cDNA were shown to be the novel gene fragments for no matched gene with them in genbank.The expression level of 4 of them,in both DM group and DM+Zn group were obviously lower than those of NC group.The expression level of DM+Zn group was higher than those of DM group(P<0.05).They were registered to genbank with the numbers of AY 952968,AY952970,DQ 351838,DQ351839,respectively. Conclusion The four novel genes differentially expressed in diabetic rats supplemented with zinc were cloned,and were successfully submitted to genbank.
Key words: diabetic rat     RT-PCR     novel gene     gene clone     zinc    

锌是人体必需的微量元素，在人体的糖脂代谢中有重要的作用。补充锌有改善糖尿病代谢紊乱的作用，但其分子机制尚不清楚。我们在前期研究中，对糖尿病大鼠每日以10 mg/(kg·bw)的剂量补锌60 d后，糖尿病大鼠糖脂代谢紊乱有了一定改善，并利用mRNA差异显示技术[1]分离到20条补锌糖尿病大鼠与糖尿病对照组大鼠之间出现差异显示的基因片段。本研究通过对这些基因片段进行克隆、测序、同源性分析等，发现了4条新基因片段，为深入研究锌调控糖尿病糖、脂代谢紊乱的分子机制提供基础依据。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

限制性内切酶EcoR I(美国Promega生物技术公司)；PCR产物回收试剂盒、质粒提取试剂盒(美国OMEGA生物技术公司)；RNA提取试剂盒RT-PCR试剂盒、(大连宝生物生物制品有限公司)；E.coliDH5a(北京天为时代科技有限公司)；pGEM-T easy载体(美国Promega生物技术公司)；DNA热循环仪(Perkin Elmer Cetus公司)；紫外透射仪(Cole-Parmer公司)；UV-2510PC型紫外分光光度计(日本岛津公司)；电泳仪(瑞典LKB公司)；Optima TM TLX台式超速冷冻离心机(Beckman公司)；Ultra-Lum凝胶成像系统等。

1.2 差异显示cDNA片段

cDNA片段来自作者的前期研究课题：健康雄性Wistar大鼠，体重150～180 g(天津药物研究院)适应性观察1周后，按体重随机留取12只大鼠为正常对照组(NC)，其余大鼠尾静脉注射四氧嘧啶［40 mg/kg·bw］,14 d后，尾静脉取血测血糖，血糖值>16.65 mmol/L者随机分为2组，每组10只，为糖尿病对照组(DM)、糖尿病补锌组(DM+Zn)。每日按10 mg/(kg·bw)的剂量对糖尿病补锌组灌胃补锌，正常对照组、糖尿病对照组每日以与补锌组同体积水灌胃。60 d后，提取各组大鼠肝脏组织总RNA，以mRNA差异显示技术分离到了糖尿病补锌组与糖尿病对照组差异显示的cDNA片段

1.3 方法 1.3.1 差异显示cDNA片段的再扩增

将上述cDNA片段以M13、T7为引物进行PCR再扩增，PCR反应条件：94℃ 2 min，94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 2 min，30个循环，72℃ 10 min。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，回收目的条带。

1.3.2 PCR产物的克隆[2]、测序及同源性分析

目的cDNA片段与pGEM-T easy载体进行连接反应，连接反应液转化感受态细胞E.coli DH5α后涂板，37℃倒置培养、摇菌。以质粒提取试剂盒提取质粒，EcoR I酶切鉴定后测序。测序结果以美国国家生物技术信息中心(NCBI)的BLASTn作为检索工具，进行同源性分析。发现有6个基因片段(Zn-2、Zn-6、Zn-10、zn-14、Zn-19、Zn-20)在GenBank中未找到高同源性的序列，为新的表达序列标签。

1.3.3 RT-PCR鉴定(表 1)
表 1 各组引物的碱基序列

根据6个新基因片段的测序结果，用引物设计软件Primer Premier5.0设计特异性引物，以正常对照组、糖尿病对照组和糖尿病补锌组每组8只大鼠肝脏标本的总RNA为模板进行RT-PCR鉴定，以验证这些差异片段是否为假阳性。PCR反应条什：94℃2 min，94℃30 s，61℃30 s，72℃1 min，28个循环，72℃7 min。PCR反应产物经1.5％琼脂凝胶电泳，对扩增条带进行图像分析，用目的基因与甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的灰度值比值大小反映待测基因在各组表达水平的高低。

1.3.4 新基因片段在Gen Bank(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)上申请登录

凡经RT-PCR验证为非假阳性片段，均在GenBank上申请登录。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行3组间mRNA表达水平的单因素方差分析。

2 结果 2.1 差示基因片段的再扩增、克隆、酶切鉴定

经过再扩增后，共分离到糖尿病补锌组与糖尿病对照组之间出现明显差异的cDNA片段20条(以Zn-1～Zn-20表示)。琼脂糖凝胶电泳确定其大小及纯度后，回收目的条带，再经连接、转化、质粒提取、EcoR I酶切鉴定，在预计位置上出现了特异条带。

2.2 差示基因片段的测序及结果分析

20个片段的测序结果在Gen Bank数据库进行同源性比较后，发现了未知的新基因片段6个；功能与糖尿病代谢密切相关的已知基因2个，功能未知的已知基因2个，其余的基因片段均与本课题无明显相关。

2.3 RT-PCR验证结果及在Genbank上登录(表 2)
表 2 新cDNA序列的同源性分析结果

以甘油醛-3-磷酸脱氢酶做为内参照物，扩增Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14、Zn-19、Zn-20基因片段。扩增产物的电泳条带进行图像分析。结果显示，Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14 mRNA的表达量在糖尿病对照组、糖尿病补锌组明显低于正常对照组(P<0.05)，在糖尿病补锌组的表达量高于糖尿病对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。Zn-20在糖尿病补锌组的表达水平低于正常对照组(P<0.05)，与糖尿病对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，可能为假阳性片段。而Zn-19的RT-PCR电泳结果在预定位置未显示出清晰的电泳条带。Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14新基因片段被Gen Bank收录。

3 讨论

Liang P建立的mRNA差异显示，在问世之初[1, 3]存在着较高的假阳性率。随着该方法的不断改进与完善，如增加引物的长度[4]，改变PCR退火温度及反应体系的浓度[5]等，使其假阳性率逐渐降低。在测序胶的分析时，以荧光标记技术替代放射性同位素使用，不但使该技术的分辨率、灵敏度均又有所提高，同时又进一步降低了假阳性率。因此，在生物学各个研究领域中，mRNA差异显示技术成为分离生命活动中特异性差异性表达基因的强有力工具。

研究结果显示[6]，糖尿病大鼠补锌后，糖脂代谢紊乱有了一定改善，并在以mRNA差异显示技术分离到的20条差异显示cDNA片段中，发现了6条未知基因片段。考虑到Northern杂交对mRNA丰度太低或cDNA片段太短的基因往往得不到杂交信号[7]，因此，我们以每组8只大鼠肝脏组织的总RNA为模板，对Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14、Zn-19、Zn-20新基因片段进行RT-PCR验证，以排除其假阳性的可能性。结果显示，Zn-2、Zn-6、Zn-10、Zn-14新基因片段在糖尿病补锌组大鼠肝脏中的表达水平高于糖尿病对照组大鼠，提示锌上调此4条新基因的表达水平可能与其改善糖尿病糖脂代谢紊乱有一定的关系。虽然在前期差异显示研究中发现Zn-20在补锌组，正常对照组和糖尿病对照组为明显的差异显示条带，且在再扩增和酶切反应后也在预计的位置出现了明显条带，但在本研究的RT-PCR验证中发现，补锌组和糖尿病对照组该条带的表达水平差异无统计学意义，因此，考虑Zn-20可能为假阳性条带。此外，Zn-19的PCR产物未能在电泳的预定位置出现清晰的条带，有待于进一步鉴别。

参考文献
[1] Liang P, Pardee AB. Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction[J]. Science, 1992, 257(5072) : 967–971. DOI:10.1126/science.1354393
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[3] Liang P, Averboukh L, Pardee AB. Distribution and cloning of eukaryotic mRNAs by means of differential display:refinements and optimization[J]. Nucleic Acids Res, 1993, 21(14) : 3269–3275. DOI:10.1093/nar/21.14.3269
[4] Liang P, Zhu W, Zhang X, et al. Differential display using one-base anchored oligo-dT primers[J]. Nucleic Acids Res, 1994, 22(25) : 5763–5764. DOI:10.1093/nar/22.25.5763
[5] Diachenko LB, Ledesma J, Chenchik AA, et al. Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1996, 219(3) : 824–828. DOI:10.1006/bbrc.1996.0317
[6] 吴蕴棠, 车素萍, 孙忠, 等. 锌、硒、铬对糖尿病大鼠糖、脂代谢调节作用[J]. 中国公共卫生, 2004, 20(9) : 1083–1085.
[7] 王夏. 快速有效筛选新的功能基因——差异显示技术[J]. 微生物学通报, 2003, 30(5) : 145–148.