中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (11): 1285-1286   PDF    
引用本文
李明成, 李凡. 儿科呼吸道致病菌氨基糖苷类抗生素耐药性[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(11): 1285-1286.
LI Ming-cheng, LI Fan Antibiotic resistance of aminoglycosides among pathogens from respiratory tract in paediatrics[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(11): 1285-1286.
儿科呼吸道致病菌氨基糖苷类抗生素耐药性
李明成1, 李凡2     
1. 北华大学医学院微生物学教研室, 吉林132021;
2. 吉林大学基础医学院病原生物学教研室
收稿日期: 2007-04-12
基金项目: 国家“十五”科技攻关计划项目 (2004BA720A09-02)
作者简介: 李明成 (1964-), 男, 吉林人, 教授, 博士, 主要从事细菌耐药性研究。
通讯作者: 李凡
摘要： 目的 探讨儿科呼吸道感染病原菌对氨基糖苷类抗生素耐药机制, 监测儿科细菌耐药性变化趋势。 方法 采集2005年4月~2006年5月儿科上呼吸道感染性标本, 常规方法分离培养细菌, 琼脂纸片 (K-B) 法进行抗菌药物敏感性监测, PCR检测氨基糖苷类修饰酶基因, PCR产物克隆测序。 结果 242份上呼吸道感染标本共分离出革兰阴性杆菌172株 (46.9%), 对链霉素耐药率超过50%以上; 对庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星和奈替米星耐药率均超过35%, 对衣替米星和地贝卡米星耐药率低于15%。对链霉素耐药细菌携带ANT (3″) 基因, 对庆大霉素耐药携带AAC (3') 基因。 结论 吉林地区儿科呼吸道感染性疾病分离出的革兰阴性杆菌对链霉素耐药率最高, 对衣替米星和地贝卡米星耐药率最低, 携带单一类型的氨基糖苷类修饰酶基因。
关键词： 儿科     抗生素     细菌耐药     呼吸道感染    
Antibiotic resistance of aminoglycosides among pathogens from respiratory tract in paediatrics
LI Ming-cheng, LI Fan     
Department of Microbiology, Medical College of Beihua University, Jilin 132021, China
Abstract: Objective To investigate the mechanism of pathogens.resistance to aminoglycosides in paediatrics.infectious diseases in Jilin regions and guide the rational use of antibiotics. Methods 242 cases of specimens from the respiratory tract were collected, and the bacteria were iso lated and identified from April in 2005 to May in 2006.The drug susceptibility were tested, the aminoglycosides modifying enzymes were detected by PCRtechnique and the PCR conducts were cloned and sequenced. Results 366 strains of bacteria were isolated from 242 specimens including 172 strains of G- bacillus accounting for 40 percent of K.pneumoniae and 28.8 percent of E.coli.The most frequent resistance to streptomycin were over 50%, the resistance to gentamycin, kanamycin, amikacin, netimycin was over 35% and the resistance to etimycin and dibamycin was lower 15%.The bacteria which were resistant to streptomy cin and gentamycin carried the ANT (3″) and AAC (3') gene respectively. Conclusion The bacteria from the respiratory tracthave the highest resistant rates to streptomycin and the lowest resistant rates to etimycin and dibamycin, which harboured the same type of aminoglycosides modifying enzymes genes used in treating diseases.
Key words: paediatrics     antibiotic     bacterial resistance     respiratory tract infection    

目前, 抗生素滥用导致耐药菌急剧增多和迅速播散, 感染性疾病治疗带来了困难, 对儿童的影响尤为突出, 甚至导致残疾或死亡112。为了解吉林省儿科感染性疾病氨基糖苷类抗生素耐药菌株的流行情况, 监测儿科呼吸道致病菌对氨基糖苷类抗生素的耐药动态, 指导临床合理使用抗生素, 本文收集2005年4月~2006年5月吉林省三级甲等医院儿科呼吸道感染性疾病病原菌, 分析携带氨基糖苷类修饰酶基因类型。现将结果报告如下。

1 对象与方法 1.1 对象

收集2005年4月~2006年5月吉林省吉林市儿童医院等儿科呼吸道感染性疾病242例, 其中男性120例, 女性122例; 年龄＜28 d 80例, ＜3岁40例, ＜7岁82例, 7~14岁40例。

1.2 方法 1.2.1 试剂

水解酪蛋白 (MH) 培养基; 药敏纸片 (Lg/片) :卡那霉素 (KNA) 10, 链霉素 (STR) 10, 壮观霉素 (SPE) 30, 奈替米星 (NET) 1000, 衣替米星 (ETI) 1000, 地贝卡米星 (DIB)1000, 妥布霉素 (TOB) 100, 庆大霉素 (GM) 10, 阿米卡星 (AMK) 50 (英国Oxoid公司); TaqDNA聚合酶、dNTP混合液、DNA分子标准参照物 (大连TaKaRa公司); QIA快速凝胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒 (德国QIAG°Cn公司)。

1.2.2 细菌分离鉴定

采集同期儿科住院呼吸道感染性标本, 包括咽拭子、气管镜吸痰液共242份。常规方法分离细菌, 细菌鉴定采用API微生物鉴定系统 (法国生物梅里埃公司) 进行。

1.2.3 药敏试验

采用琼脂纸片扩散法, 测定9种氨基糖苷类抗菌药物的敏感性, 药敏判定标准依据美国临床实验室标准化委员会 (NCCLS2002) 规定执行。大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌AT CC27853作为药敏质控菌株122。

1.2.4 PCR检测氨基糖苷类修饰酶基因

(1) DNA模板制备:取细菌接种3 ml含抗生素Luria-B°Cr tani培养基, 震荡培养过夜, 取1 000Ll培养于115 ml离心管中, 12 000r/ min离心2 min, 弃上清, 加1 000 Ll双蒸水, 置100 °C水浴10 min, 立即置-20°C冰箱冷冻10 min。12 000 r/ min离心5 min, 上清液为DNA模板。(2) 引物设计:由上海生物工程公司合成。核苷转移酶 (ANT) :上游引物5c-CTTGATGAAACAAGGCGG-3c;下游引物5c-TACCAAATGCGGGACAAC-3c;乙酰转移酶 (AAC) :上游引物5c-CGTACAGGAACAGTACTTGC-3c;下游引物5c-TTT GAACCAGTACACGG-3c;磷酸转移酶 (APH) :上游引物5c-GCCGATGTGGATTGCAAAA-3c;下游引物5c-GCTTGAT CCCCAGTAAGTCA-3c。(3) PCR反应:反应体系50 Ll, 在015 ml PCR反应管中依次加入: 10 @缓冲液5 Ll, dNTPs (每种dNT P溶液浓度为21 5 mmol/ L) 4 Ll, 10 pmol/ L引物1和引物2各115 Ll, TaqDNA聚合酶 (1U) 11 25 Ll, 模板2 Ll, 双蒸水补至50 Ll。以标准菌株做阳性对照, ATCC25922作阴性对照。(4) 反应程序: 94 °C预变性5 min, 94°C 1 min, 56°Clmin, 72°Clmin, 30个循环, 72°C延伸5min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，分子量100~2 000bp的DNA Marker作参照，用凝胶成像分析系统观察和分析结果。

1.2.5 PCR产物纯化、连接、克隆和测序

用QIA快速凝胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒按说明书方法对扩增产物回收、纯化。纯化产物与pMD19-T载体连接、转化DH5A感受态细胞, 篮白筛选阳性克隆株。用双脱氧链末端终止法，在ABIPRISM™ (美国Perkin Elmer公司）自动测序仪上进行，同一样品经正反测序。所测序列采用DNAstar软件进行序列拼接、校正和氨基酸序列的推导，在www.ncbi.nlm.nihi.gov网站上的GerieBank数据库采用Standard nucleotide nu-cleotic BLAST软件, 对获得的基因片段进行同源性分析

2 结果 2.1 儿科呼吸道感染疾病常见病原菌分布

242份标本中分离出366株细菌，其中革兰阴性杆菌172株，占46 9%。其中包括肺炎克雷伯菌68株，占40. 0%;大肠埃希菌49株，占28 8%;铜绿假单胞菌34株，占20 0%;鲍曼不动杆菌21株, 占11. 2%。

2.2 耐药性检测（表 1)

革兰阴性杆菌对链霉素耐药率超过50%以上; 对庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星耐药率超过35%, 对衣替米星和地贝卡米星耐药率低于15%。

表 1 儿科呼吸道感染疾病常见病原菌对氨基糖苷类抗生素耐药率 (%) 比较

2.3 氨基糖苷类修饰酶基因检测及测序（图 1, 图 2)

对链霉素耐药的菌株均检出350bp的核苷转移酶（ANT) 耐药基因，经测序与Gene Bank ANT (3) 有100%同源性；对庆大霉素、卡那霉素耐药菌株均检出360 bp乙酰转移酶（AAC) 耐药基因，与Gene Bank AAC (3) 有100%同源性，而磷酸转移酶 (APH) 基因均未检出。

注: 1: Marker; 2~6:阳性标本; 7:阳性对照; 8:阴性对照。 图 1 ANT (3'') 耐药基因琼脂糖凝胶电泳图谱

注: 1: Marker; 2~5:阳性标本; 6:阳性对照; 7:阴性对照。 图 2 AAC (3') 耐药基因琼脂糖凝胶电泳图谱

3 讨论

我国儿科临床经验用药有青霉素、头孢菌素和大环内酷类。由于其抗菌谱广，疗效显著, 在医学和畜牧兽医界广泛应用，但耐药问题随之出现。由于耐药菌株的广泛播散，不仅使许多抗菌药物的疗效降低，而且对儿童会造成诸多负面影响[3]。吉林省儿科住院患者呼吸道标本分离出的病原菌对氨基糖苷类抗生素耐药性有差异, 对链霉素耐药率超过50%以上；对庆大霉素、卡那霉素、阿米卡星、奈替米星耐药率超过35%对衣替米星和地贝卡米星耐药率低于15%。病原菌携带氨基糖苷类灭活酶ANT (3") 基因和AAC (3') 基因，分别传递对链霉素、壮观霉素和庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素的耐药性。耐药钝化酶的产生与环境中选择压力密切相关，与用药模式无关，而和氨基糖苷类抗生素的应用总量相关。链霉素、庆大霉素、妥布霉素、卡那霉素是应用最早的氨基糖苷类抗生素，与之相应的耐药性和钝化酶的检出率逐年上升[6]。本实验只设计3种钝化酶通用引物，通过克隆测序确定相应的亚型，避免合成更多亚型的引物。

氨基糖苷类是一类毒性较强的药物，是治疗结核分枝杆菌和危及生命的革兰阴性杆菌严重感染的首选药物。因此，临床要严格掌握适应症，孕妇和6岁以下儿童要禁用。使用疗程不宜超过2周，应用时要注意监测听力、前庭功能、尿常规和肾功能，一旦出现异常, 应即刻减量或停药。

防止氨基糖苷类抗生素耐药细菌通过质粒、整合子传播及患者间的交叉感染和暴发流行，临床医生要掌握菌株耐药机制、合理应用抗菌药物，从各个环节加强管理，杜绝或减少耐药菌株的发生和发展[7]。

参考文献
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