土霉素(OTC)是一种广谱抗菌药物，被广泛用于治疗奶牛乳房炎，因此，极易残留到牛奶中，从而危害人体健康。世界卫生组织及我国政府对牛奶中土霉素的残留均有严格的规定，其残留量不得高于100 μg/L^[1]。因此，建立简便、快速、灵敏的土霉素残留的检测方法非常重要。本文采用多壁碳纳米管修饰玻碳电极作为工作电极，利用线性扫描伏安法对牛奶中土霉素残留进行高灵敏度、高选择性测定，该方法简单可靠、电极制作方便、重现性好。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 仪器与试剂

CHI660A型电化学工作站(上海辰华仪器公司)；采用三电极系统：多壁碳纳米管修饰玻碳电极为工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl溶液)电极为参比电极，铂丝电极为对电极。土霉素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：130487-200302，含量88.2%)溶于0.1 mol/L HCl，配成1.0×10^-3mol/L的标准溶液，使用前按需要稀释。双十六烷基磷酸(瑞士Fluka公司)；多壁碳纳米管(南京大学化学化工学院生命分析化学教育部重点实验室)；其他试剂均为分析纯并按常规方法配制，实验用水为二次蒸馏水。

1.2 多壁碳纳米管(MWCNT)修饰玻碳电极的制备

将5 mg MWCNT和5 mg双十六烷基磷酸(DHP)加入5 ml二次蒸馏水中，超声分散20 min直至得到1 mg/ml均一、浅黑色的MWCNT-DHP悬浮液。玻碳电极(有效直径为3 mm)依次用0.3 μm、0.05 μm Al₂O₃粉及麂皮抛光至镜面，然后依次在无水乙醇和二次蒸馏水中超声清洗3 min,红外灯下烘干。用微量进样器取15 μl上述悬浮液滴加在玻碳电极表面，红外灯下挥发掉溶剂制得MWCNT修饰玻碳电极。

1.3 实验方法

MWCNT修饰玻碳电极先在10 ml 0.1 mol/L柠檬酸钠-HCl缓冲液(pH 2.0)中经循环伏安扫描(-0.40~-1.20 V)活化修饰电极直至循环伏安曲线稳定为止。然后加入一定量的土霉素标准溶液，通氮气除氧10 min，在搅拌条件下开路富集3 min，静止30 s后用线性扫描伏安法(LSV)在-0.40~-1.20 V区间以100 mV/s的扫描速度进行测定，测量-1.10 V处土霉素的还原峰电流。每次测定后，电极在空白底液中经循环扫描以除去吸附在表面的沉积物，恢复其催化活性。

2 结果 2.1 测定底液的选择

利用线性扫描伏安法研究1.0×10^-5mol/L土霉素在pH 5.0~8.0的磷酸盐缓冲液、pH 2.0~10.0的B-R缓冲溶液、pH 1.0~5.0的柠檬酸钠-HCl缓冲溶液及pH 4.0~6.0的NaAc-HAc缓冲溶液(浓度均为0.1 mol/L)中的电化学行为。结果表明，土霉素在pH 1.0~5.0的柠檬酸钠-HCl缓冲溶液中还原峰电流较高，峰形较好。在0.1 mol/L的柠檬酸钠-HCl缓冲溶液中进一步研究了pH值对土霉素还原峰电流的影响。当pH值从5.0逐渐降低到2.0时，还原峰电流随之增加，当pH值从2.0继续降低到1.0时，还原峰电流变化不明显，但背景电流急剧增加，不利于测定。因此，本实验选择pH 2.0的0.1 mol/L的柠檬酸钠-HCl缓冲溶液作为测定土霉素的最佳介质。

2.2 修饰剂用量的影响

实验表明，滴加在玻碳电极表面的MWCNT-DHP悬浮液用量对土霉素的还原峰电流有很大的影响。当悬浮液用量从0逐渐增加到10 μl时，由于电极表面活性位点的增多，导致还原峰电流显著增加。当悬浮液用量从10 μl增加到17.5 μl的过程中，还原峰电流变化不明显，几乎维持在一固定值。但当悬浮液用量继续增大时，还原峰电流反而逐渐降低，这是因为此时电极表面的DHP太多，其绝缘效应会降低修饰电极的导电性能。本实验采用15 μl的1 mg/ml的MWCNT-DHP悬浮液用量来制备化学修饰电极。

2.3 富集电位和时间的影响

在上述实验条件下，考察了土霉素还原峰电流随富集电位的变化。当富集电位从0.40~-0.40 V变化时，还原峰电流几乎不变，说明富集电位对土霉素在MWCNT修饰玻碳电极上的电化学还原过程几乎没有影响，所以本实验选择开路富集。在选定的富集电位下，富集时间从0增加到3 min的过程中，还原峰电流几乎线性增加，但当超过了3 min后，峰电流增加缓慢，进入平台区，说明土霉素在电极表面吸附迅速达到饱和。本实验选用3 min的富集时间以提高分析灵敏度及缩短分析时间。

2.4 线性范围、检出限及电极重现性

在上述优化实验条件下利用线性扫描伏安法研究了土霉素还原峰电流与浓度的关系，并绘制标准曲线。结果表明，土霉素的还原峰电流与其浓度在1.0×10^-7~6.0×10^-5mol/L的范围内呈现良好的线性关系，其线性回归方程为ip(μA)=0.14+1.13×10^-7C(mol/L)，r=0.9979。开路富集3 min的检出限为4.0×10^-8mol/L(按3倍信噪比估算)。对1.0×10^-5mol/L土霉素平行测定10次的相对标准偏差(RSD)为4.6%，说明此修饰电极具有很好的重现性。此外还考察了该修饰电极的使用寿命。该电极每天测定一次，然后在空白底液中经循环伏安扫描活化后存放在空气中，4周后对1.0×10^-5mol/L土霉素的测定信号仅下降约5.3%，这表明该修饰电极具有良好的稳定性和较长的使用寿命。

2.5 干扰实验

1 000倍的Pb²⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cd²⁺、K⁺、Al³⁺、Cl^-、NO₃^-、SO₄^2-、PO₄^3-,50倍的抗坏血酸(AA)、尿酸(UA)、多巴胺(DA)、维生素E等几乎不干扰1.0×10^-5mol/L土霉素的测定(误差＜4%)，而10倍的四环素与多西环素等对测定干扰严重。

2.6 实际样品分析(表 1)

准确移取10 ml超市销售某纯牛奶样品与10 ml 10%(V/V)盐酸溶液混合，超声振荡3 min使均质。移入离心管，12 000 r/min离心15 min。用注射器吸取上清液过0.45 μm醋酸纤维滤膜，弃去初滤液，取续滤液待测。在选定的最佳实验条件下，利用线性扫描伏安法对其进行测定，结果未检测出土霉素残留。另外按照标准加入法进行加标回收率实验，加标回收率在88%~104%之间，同时利用药典标准方法^[2]测定加标试液，进行对照实验。

3 讨论

碳纳米管具有独特的电学、物理和化学性能，在众多领域有着广阔的应用前景^[3]。本研究用多壁碳纳米管修饰在玻碳电极上，运用线性扫描伏安法研究了土霉素在该修饰电极上的电化学行为，发现该修饰电极对土霉素的电化学还原产生明显的电催化作用，并在此基础上发展了直接测定牛奶中土霉素残留的电化学分析方法。通过标准曲线的绘制与实际样品的分析，可知该修饰电极具有很好的重现性与选择性及高灵敏度，抗干扰能力强，牛奶样品中的无机盐与蛋白质等几乎不干扰土霉素的测定，仅一些四环素类的药物由于其基本结构相似而干扰严重。与先前报道的牛奶中土霉素残留的测定方法^{[4, 5]}比较，特别是在与药典标准方法^[2]进行对照实验后，发现本文提出的方法具有操作简便快速、灵敏度高、结果可靠等特点，是一种测定牛奶中土霉素残留的有效手段，具有较好的实际应用前景。