中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (10): 1242-1244   PDF    
引用本文
吕刚, 胡旭初, 黄灿, 李艳文, 徐劲, 吴忠道, 余新炳. 日本血吸虫乳酸脱氢酶原核表达、纯化及鉴定[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(10): 1242-1244.
LV Gang, HU Xu-chu, HUANG Can, et al. Prokaryotic expression, purification and identification of lactate dehydrogenase from schistosome japonicum[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(10): 1242-1244.
日本血吸虫乳酸脱氢酶原核表达、纯化及鉴定
吕刚1,2, 胡旭初1, 黄灿1, 李艳文1, 徐劲1, 吴忠道1, 余新炳1     
1. 海南医学院寄生虫学教研室, 海口 571101;
2. 中山大学基础医学寄生虫学教研室
收稿日期: 2007-01-28
基金项目: 国家自然科学基金(30571633)
作者简介: 吕刚(1963- ),男,浙江永康人,副教授,博士,研究方向:分子寄生虫学。
通讯作者: 余新炳
摘要： 目的 原核表达日本血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH),对表达产物进行纯化及生物活性鉴定。 方法 将SjLDH编码序列克隆入pET-28a原核表达载体并转染大肠埃希菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后亲和层析法对表达产物进行纯化,并用聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白印迹(Western blot)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、酶活性染色及活性测定进行鉴定。 结果 成功构建pET28a-SjLDH重组质粒并在大肠埃希菌中获得可溶性表达,亲和层析纯化表达产物。SDS-PAGE及Western Blot结果显示,表达及纯化产物分子量约36kDa,与SjLDH理论分子量相符。ELISA结果表明,重组蛋白具有良好的免疫活性,酶活性染色表明重组蛋白具有乳酸脱氢酶活性,活性单位为379U/mg。 结论 成功进行SjLDH的原核表达并获得纯化的重组蛋白,重组蛋白具有良好的免疫原性及酶活性,为研究SjLDH的功能奠定了基础。
关键词： 日本血吸虫     乳酸脱氢酶     原核表达     纯化     重组蛋白    
Prokaryotic expression, purification and identification of lactate dehydrogenase from schistosome japonicum
LV Gang, HU Xu-chu, HUANG Can, et al     
Abstract: Objective To express SjLDH in prokaryotic expression system,purify and identify the protein expressed. Methods The encoding fragment of SjLDH was inserted into plasmid pET-28a and the recombiant plasmid p ET2-8a-SjLDH was transformed into E.coli BL21 and induced by IPTG.The expressed products were purified by affinity chromatography column and identified by SDS2PAGE,Western blot,EL ISA,enzymatic vital staining and enzymatic activity detection. Results Recombinant plasmid p ET2-8a-SjLDH was constructed and expressed in E.coli successfully.A 362kDa protein with 6×His-tag was purified by affinity column and identified by SDS-PAGE and Western blot,which had high LDH activity of 379 U/mg and high immunological activity. Conclusion Recombinant SjLDH was obtained successfully,which had high enzymatic activity and immunological activity.This work provided the essential material for the functional study on SjLDH.
Key words: schistosome japonicum     lactate dehydrogenase     prokaryotic expression     purification     recombiant protein    

血吸虫的能量主要来源于无氧糖酵解，糖酵解途径相关酶与血吸虫的生存密切相关，可能是潜在的药物作用靶分子或疫苗候选分子。乳酸脱氢酶(LDH)是糖酵解途径的末端酶，在还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)及氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)辅助下催化丙酮酸还原为乳酸及乳酸氧化为丙酮酸的可逆反应。从分子水平开展血吸虫乳酸脱氢酶的酶学特性、免疫活性及抗血吸虫药物对其活性影响等方面的研究，有助于了解血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH)的催化特性及其在血吸虫病的免疫诊断、疫苗以及抗血吸虫药物研究方面的应用价值。本研究在已知SjLDH全长cDNA序列的基础上[1]，对SjLDH进行原核表达、纯化及鉴定，以期获得有生物学活性的重组蛋白，为进一步的功能研究打下基础。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株和质粒

重组质粒pGEX-4T-1-SjLDH、质粒pET28a(+)、大肠埃希菌BL21(DE3)为本室保存。

1.1.2 引物设计

根据已知SjLDH全长编码序列设计引物：Sjldh1:GCCGAATTCATGCCGTCATCTTGT(下划线为EcoRI酶切位点)，Sjldh2:GCGCTCGAGTTACCACTTAATTCC(下划线为XhoI酶切位点)(上海博亚公司合成)。

1.1.3 主要试剂

Taq酶、dNTP、限制性内切酶EcoRI、XhoI、T4DNA连接酶及Marker DL2000(大连宝生物公司)；质粒提取、凝胶回收试剂盒、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(上海申友公司)；十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺、二硫苏糖醇(DTT)等(北京鼎国生物制品公司)；His Bind Purification Kit(德国Novagen公司)；聚醚二砜膜(PVDF)(美国Millipore公司)；3，3′-二氨基联苯胺(DAB)、兔乳酸脱氢酶(rLDH)、吩嗪硫酸甲酯(phenazine methosulfate,PMS)、氯化氮篮四唑(nitroblue tetrasolium chloride,NBT)、丙酮酸(pyruvate)、乳酸(lactate)、NADH及NAD+(美国Sigma公司)；96孔聚苯乙烯酶标板(美国Costar公司)；小鼠抗组氨酸标签单克隆抗体(美国Invitrogen公司)；羊抗小鼠辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗(武汉博士德公司)。

1.1.4 抗原及血清

日本血吸虫成虫粗抗原(AWA)为新鲜成虫匀浆上清，蛋白浓度为2.5 mg/ml。阴性血清：取10只正常昆明鼠，眼球取血，分离血清，-80℃保存备用。阳性血清：取10只昆明鼠，腹部经皮肤感染尾蚴(40±1条/只)，感染后每周尾部取血，分离血清，-80℃保存备用，连续采血13周。

1.2 方法 1.2.1 SjLDH原核表达载体(pET-28a-SjLDH)的构建及鉴定

参照文献[2]方法以重组质粒pGEX-4T-1-SjLDH(本实验室先前构建)为模板，将目的片段亚克隆入质粒pET-28a EcoRI、XhoI酶切点位点构建重组质粒pET-28a-SjLDH，转化大肠埃希菌BL21，重组质粒经酶切琼脂糖凝胶及测序鉴定。

1.2.2 SjLDH的原核表达及鉴定

IPTG(终浓度1 mmol/L)37℃诱导pET-28a-SjLDH转化菌3 h，离心收集菌体进行聚丙烯酰胺变性凝胶电泳(SDS-PAGE)，考马斯亮蓝蛋白染色液染色[2]。Western Blot鉴定：SDS-PAGE电泳，凝胶根据转移电泳装置(DYCZ-40D型，北京六一仪器厂)说明书操作，100 mA转移电泳1 h，将蛋白转印于PVDF膜。低分子量蛋白Marker用氨基黑染液染色，待鉴定PVDF膜在1∶1000的小鼠抗6×His单克隆抗体室温杂交1 h，(PBS)漂洗2次，1∶400稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体室温杂交30 min，PBS漂洗2次，DAB溶液显色，超纯水终止反应。

1.2.3 重组SjLDH的纯化及鉴定

相同条件诱导表达，4℃8 000 r/min离心收集菌体，重悬菌体，4℃超声破菌，12 500 r/min离心20 min，收集上清。亲和层析按试剂盒说明书进行，纯化产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定。收集的纯化蛋白合并于透析袋中，pH 7.4 PBS 4℃磁力搅拌过夜，换液3次，Bradford法测定蛋白浓度，加0.1%灭菌甘油-80℃保存备用。

1.2.4

重组蛋白的非变性电泳酶活性染色及酶活性测定重组蛋白的非变性电永及酶活性染色参照文献[3]方法，酶活性测定参照文献[4]方法。

1.2.5 重组蛋白的免疫活性鉴定

用包被缓冲液将重组蛋白及血吸虫成虫粗抗原稀释至5 μg/ml包被96孔聚苯乙烯酶标板，常规ELISA法测定。

2 结果 2.1 SjLDH原核表达载体(pET-28a-SjLDH)的构建及鉴定(图 1)

用特异性引物对原重组质粒pGEX-4T-1-SjLDH进行PCR扩增，获得一个约1 000 bp的片段，测序为999 bp，与原来结果完全相符。将扩增产物插入到质粒pET-28a构建pET-28a-SjLDH重组质粒，构建的重组质粒经PCR、双酶切琼脂糖凝胶及测序鉴定，表明重组质粒构建成功。

注:M1 :DNA marker 15 000 ;1 :pET-28a 双酶切( EcoRI + Xho I) ;2 :pET228a-SjLDH 双酶切( EcoRI + Xho I) ;3 :pET228a-SjLDH PCR 产物;M2 :DNA marke 2 000 。 图 1 pET228a-SjLDH重组质粒及PCR扩增产物的双酶切鉴定

2.2 目的基因的原核表达、纯化及鉴定(图 2,图 3)

pET-28a-SjLDH转化菌经诱导表达后，电泳显示，在分子量约36 kDa处出现一明显条带，与SjLDH的理论分子量为36.120kDa基本相符。菌体裂解上清经过亲和层析柱层析，获得一分子量约36kDa蛋白。由于pET系列载体表达的融合蛋白均带有6×His标签，用小鼠抗6×His单抗体Western blot。结果显示，重组菌诱导后、裂解上清以及纯化产物均有分子量约36kDa带有6×His标签的目的蛋白，即重组SjLDH。

注:1 :pET2-8a 未诱导;2 :pET-28a 诱导后;3 :pET-28a-SjLDH 未诱导;4 :pET-28a-SjLDH诱导后;5 :pET-28a-SjLDH诱导后菌体可溶性上清;6 :纯化产物;M:低分子量蛋白marker。 图 2 pET228a-SjLDH原核表达及纯化产物的SDS2PAGE鉴定

注:1 :pET-28a 未诱导;2 :pET-28a诱导后;3 :pET-28a-SjLDH 未诱导;4 :pET-28a-SjLDH诱导后;5 :pET-28a-SjLDH诱导后菌体可溶性上清;6 :纯化产物;M:低分子量蛋白marker。 图 3 pET-28a-SjLDH原核表达及纯化产物的Western blot 鉴定

2.3 重组SjLDH的酶活性染色及酶活性测定(图 4)

兔LDH及重组蛋白经非变性PAGE电泳后，进行特异性LDH酶活性染色，对照组兔LDH(1、2孔)及重组蛋白组(3、4孔)均有蓝紫色条带呈现，证明重组蛋白具有LDH酶活性，经测定重组蛋白的酶活性单位为379 U/mg。

注:1,2 :兔LDH;3 ,4 :重组蛋白。 图 4 兔LDH及重组蛋白酶活性染色

2.4 重组SjLDH的免疫活性测定(图 5)

以重组SjLDH及AWA为抗原常规ELISA法检测感染小鼠组与未感染小鼠组血清中相应的抗体。2种抗原均有良好的免疫活性，AWA略高于重组蛋白，抗体在感染1周后开始出现，随后逐渐上升，至第7周达到高峰，之后略有下降，维持在一个相对较高的水平。

图 5 以重组SjLDH、AWA 为抗原ELISA 检测感染小鼠( 1~13 周) 血清抗体水平

3 讨论

LDH是糖酵解途径中的关键酶之一，在寄生虫生长、发育过程中起着重要作用。对疟原虫LDH(pLDH)的研究表明，pLDH与宿主动物LDH在生化、免疫学特性和酶学方面有很大差异，具有种、属特异性，是检测疟原虫理想的靶抗原以及潜在的药物作用靶标[4, 5]。吡喹酮和蒿甲醚是重要的抗血吸虫药物[6]，但它们的分子作用机制目前尚未完全明了。文献报道吡喹酮对体外培养的杯尾盘殖吸虫(Cotylophoron cotylophrum)作用24 h后，虫体匀浆上清LDH活性被抑制达85%[7]；用蒿甲醚灌服日本血吸虫感染小鼠24~72 h，虫体LDH活性分别被抑制9%~59%(雄性)及41%~75%(雌性)[8]。以上结果提示吡喹酮、蒿甲醚可能作用于糖酵解途径的末端酶LDH。但由于虫体药物实验影响因素较多，虫体在药物作用24 h后可能死亡或活性大大降低，不能反映真实情况，药物是否对LDH具有抑制作用需从分子水平进行验证。

本研究在获得SjLDH全长cDNA序列的基础上，成功进行了该基因在原核表达系统的可溶性表达并进行纯化，得到了具有生物学活性的重组SjLDH。鉴定结果表明，该重组蛋白具有良好的免疫活性，其抗原性与AWA相当，可能是良好的免疫诊断及疫苗的候选分子；重组SjLDH具有较高的LDH酶活性，为从分子水平探讨吡喹酮及蒿甲醚抗寄生虫药物的作用机制及筛选新的抗寄生虫药物提供了一个良好的分子模型。

参考文献
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