吗啡类药物的作用原理是与边缘系统的阿片受体结合而消除由疼痛所引起的情绪变化；与兰斑核中的阿片受体结合，则可能与引起欣快症有关^[1]。阿片受体在脑内分布密度较高的区域有，内侧丘脑、脑室以及导水管周围的灰质。阿片受体在脑内分布密度最高区域有边缘系统以及兰斑核。目前，己有许多研究表明，基底前脑胆碱能系统与认识功能有密切关系，而胆碱能神经原在记忆功能中起着主要作用^[2]。本文建立了大鼠吗啡依赖模型，观察大鼠海马CA1区AChE含量的变化。

1 材料与方法 1.1 材料

碘化乙酰硫胆碱(美国Sigma公司)；盐酸吗啡(青海制药厂)；LUZEX-F显微图像分析从(日本松下公司)；日立H-600透射电镜。

1.2 实验动物分组

选用雄性Wistar大鼠(中国医科大学动物室)40只，体重260~300 g，随机分成2组。正常对照组、实验组各20只。

1.3 方法 1.3.1 吗啡依赖性大鼠模型制备

实验组背部用递增法注射盐酸吗啡，建立吗啡依赖动物模型。皮下注射吗啡5 d。1~5 d剂量分别为每次5，10，20，40，50mg/kg，每天3次(8：00，12：00，16：00)即可使动物依赖。

1.3.2 组化标本制备

对实验动物用1％戊巴比妥钠(40 ml／kg)腹腔麻醉后开胸，经左心室70滴/min滴入1％肝素钠的生理盐水500 ml，同时剪开右心耳。用 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(PBS，pH=7.4)配制的固定液(含4％多聚甲醛)灌流固定。取出实验动物的大脑组织，放入含4％多聚甲醛PBS固定液中进行固定后大约2 h，将实验动物的大脑组织切成薄片移入含20％蔗糖的PBS中。在4℃冰箱中存放，至组织薄片沉底，经水包埋，恒冷箱连续横切片，片厚20 μm。经光学相干层技术(OCT)包埋，恒冷箱连续切片，片厚16μm，-70℃保存备用。

1.3.3 尼氏染色

冰冻切片吹干，经PBS漂洗5 min×3次，将切片置入1％甲苯胺蓝溶液中37℃孵育90 min，取出后用蒸馏水冲洗，PBS漂洗5 min×3次，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.3.4 透射电镜技术

各组动物在1％戊巴比妥钠(40 mg／kg·bw)腹腔麻醉下，用含1％肝素钠生理盐水200 ml快速冲洗后，用2％多聚甲醛及2.5％戊二醛的0.1 mol／L磷酸缓冲液250 ml灌流固定，灌流后立即取脑，参照包新民大鼠脑图谱切取海马组织块置于4℃，2.5％戊二醛中固定24 h，经1％锇酸固定1 h后，常规脱水，Epon 812包埋，超薄切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重染色，日立H-600透射电镜观察并拍片。

1.3.5 乙酰胆碱脂酶组织化学方法

(1)作用液的构成：0.82％的醋酸钠；0.6%的醋酸；2.94％柠檬酸钠；0.75％硫酸铜；0.165％铁氰化钾；双蒸馏水；碘化乙酰硫胆碱。(2)切片在作用液中放置于37℃温箱内30~120 min。(3)切片着色后蒸馏水冲洗。(4)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察。

1.4 显微图像定量分析

用Luzex-F显微图像分析仪测定海马CA1区单位面积AChE阳性反应物平均灰度值和阳性反应物密度。

1.5 统计分析

采用SAS软件进行统计学处理。

2 结 果 2.1 尼氏染色和透射电镜结果

正常对照组大鼠海马的尼氏染色切片上，神经元数量较多，排列紧密，形态完整，泡浆内尼氏体丰富。实验组，正常神经元数量减少，细胞皱缩，有的溶解成碎片。实验组大鼠海马神经元出现明显的改变，核皱缩、核膜部分溶解、消失；线粒体肿胀、嵴紊乱甚至缺失；内质网扩张、脱颗粒；高尔基体扁平囊腔扩张；突触数量减少、前后膜融合、突触小泡不清或出现聚集。根据尼氏染色和透射电镜结果证明吗啡依赖性动物模型制备成功。

2.2 酶组织化学结果

正常对照组可见AChE阳性反应物分布于大鼠海马各区，阳性反应物呈棕褐色，分布于胞质及突起，胞核不着色，细胞形态完整但细胞数量少，纤维丰富。与正常对照组比较，实验组AChE阳性反应物大量减少(P＜0.01)；未见阳性细胞，纤维减少、断裂，见表 1。

3 讨 论

神经末梢释放乙酰胆碱递质的神经，称胆碱能神经，目前，还没有直接显示乙酰胆碱的组织化学方法。一般利用水解乙酰胆碱的酶-乙酰胆碱酯酶来显示胆碱能神经细胞的组织化学特性，并认为乙酰胆碱的分布大致上与乙酰胆碱酯酶的分布一致。乙酰胆碱脂酶不仅存在于中枢神经系统而且也存在于周围神经系统中。所以，早在20世纪60年代就开始应用乙酰胆碱酯酶进行酶组织化学检测^[3]。在大鼠海马培养细胞中AChE阳性神经元数量较少，而存在有大量的阳性纤维，胞体呈中强度染色。在本实验结果中可以看到，正常对照组海马内含有AChE阳性神经元和大量的阳性纤维，而实验组未见AChE阳性神经元并且阳性纤维大大减少，这可能是由于吗啡瘾的产生，使海马区的神经原受到损伤后，海马神经元受损致使部分投射中断，乙酰胆碱释放减少所致，而乙酰胆碱的减少使海马缺乏递质的营养，也可导致神经元损伤加重。大鼠产生吗啡瘾时海马内AChE含量减少，提示AChE在海马中具有重要的生理作用。同时本实验应用酶组织组织化学方法证明吗啡依赖性大鼠海马AChE酶组织化学反应阳性细胞及纤维数量显著减少。结果提示，AChE可能参与吗啡依赖性的病理生理过程，并且作为神经元受损的标示物。