牛奶是人类主要的食品之一。现代牛奶中含有相当数量的雌性激素。Remesar X等^[1]计算人类饮食中雌酮吸收率时，发现西方饮食中46.6%来源于牛奶及乳制品。有文献报道，大约75%的市售牛奶来源于妊娠奶牛^[2]。儿童是牛奶消费的主要群体之一。妊娠奶牛奶中的雌性激素是否会对儿童产生危害，相关文献或动物实验报告较少。本实验通过分别喂食幼年雌性SD大鼠妊娠奶牛奶、市售牛奶及配对饲料，检测尿液中雌性激素含量，了解妊娠奶牛奶和市售牛奶对雌性幼鼠雌性激素代谢的影响。

来源于当地农场的荷斯坦黑白花奶牛(妊娠105d)，采集后立即冷藏，并取50 ml作为待测样本。

购自当地市场，为同一品牌盒装全脂纯牛奶，全部拆装后混合，立即冷藏，并取50ml作为待测样本。

油面筋(购自当地市场)；赖氨肌醇维B12口服溶液(江苏济川制药有限公司)；钙尔奇D片(惠氏制药有限公司)。

清洁级雌性SD大鼠(浙江省实验动物中心)36只，21日龄，体重(54.7±3.6)g，合格证号为SCXK2003-0001。

将上述待测样本连测3次，取其均值。(1)雌激素检测：牛奶中雌激素有游离型和结合型2种形式。游离雌二醇(E₂)和雌三醇(E₃)采用免疫化学发光法(Immunochemiluminometric assays,ICMA)直接检测待测样本。总的雌二醇或雌三醇(即游离型+结合型)检测样本处理如下：从待测样本中抽取试样0.45 ml，将其加入0.5 ml乙酸钠缓冲液中，再加入0.05 ml硫酸酯酶溶液(含50U硫酸酯酶)，在37℃水溶下孵育20 h后，用ICMA检测上述混和液(乙酸钠为100 mmol/L，氯化钠为0.02%)中E2和E3，总雌二醇或总雌三醇浓度=所测浓度÷0.45。(2)孕激素检测：采用ICMA直接检测待测样本中孕酮。

根据GB/T5009.46-2003，检测脂肪、含脂固体、非脂固体；根据GB/T5009.5-2003，检测蛋白质。

(1)动物分组：将36只幼鼠随机分为妊娠奶牛奶、市售牛奶和对照组，每组12只，体重分别为(55.0±4.0)，(54.2±3.7)和(54.8±3.6)g，3组体重差异无统计学意义(P＞0.05)。专人饲养，室温(20±1)℃。(2)给饲方法：妊娠奶牛奶组每日每只给予妊娠奶牛奶20 ml，市售牛奶组每日每只给予市售牛奶20 ml，对照组每日每只给予定量配对饲料。一鼠一笼，单独喂食，在规定的妊娠奶牛奶、市售牛奶或配对饲料完成后自由取食鼠饲料和自来水。(3)尿液收集：喂食10 d后，按编号(奇数鼠第1 d，偶数鼠第2 d)分批用代谢笼收集3组幼鼠24 h尿液，2 d完成收集，记录尿量，留尿5 ml为样本，置-20℃下储存。尿液收集结束时称量幼鼠的体重，并根据体表面积(Surface Area,S)公式(S=0.0913×体重^2/3)，计算幼鼠的体表面积。

检测前室温下溶解尿液，取0.4ml尿液加入0.5 ml乙酸钠缓冲液中，再加入0.1 ml硫酸酯酶溶液(含100U硫酸脂酶)，在37℃水浴下孵育20h后，用ICMA检测上述混和液(乙酸钠为100 mmol/L，氯化钠为0.02%)中雌三醇及孕酮，24 h尿雌三醇或孕酮的量=(所测浓度÷0.4)×尿量。同时检测尿中肌酐(Creatinine,Cr)的浓度。

激素检测采用全自动免疫化学发光分析仪(Accessimmunoassay system)及配套试剂(美国BECKMAN)；硫酸酯酶(西格玛奥德里奇上海贸易有限公司)；体重称量采用台式电子秤(精确读数至2 g)；尿液测量采用100 ml量筒(准确读数至2 ml)；Cr检测采用HITACHI 7170A全自动生物化学分析仪及配套试剂(日本日立公司)。

运用SPSS 10.0软件进行分析，并进行Levene检验，方差齐性的数据作F检验，方差不齐性数据作Kruskal(W)allis H检验，并用t检验作两两比较等。

(1)妊娠奶牛奶：游离雌二醇和总雌二醇分别为36.2和751.6 pg/ml；游离雌三醇和总雌三醇分别为40.7和417.0 pg/ml。孕酮为9.83 mg/ml；(2)市售牛奶：游离雌二醇和总雌二醇分别为39.7和1 609.9 pg/ml;游离雌三醇和总雌三醇分别为37.3和859.3 pg/ml。孕酮为7.59 ng/ml。

妊娠奶牛奶中蛋白质、脂肪、含脂固体和非脂固体和排脂固定分别占3.24%，1.97%，11.19%和9.22%；市售牛奶中蛋白质、脂肪、含脂固体和排脂固体分别占3.24%，3.93%，12.77%和8.84%；油面筋中蛋白质和脂肪分别占43.89%和55.94%。根据上述检测结果，给对照组每日每只幼鼠补充油面筋2.22 g，赖氨酸33.5 mg，钙元素20.5 mg，使对照组的蛋白质、钙等营养素与2个牛奶组保持相对平衡。

各组幼鼠的24 h尿量、体重和体表面积Levene检验，P均＞0.05，可认为方差齐性；各组幼鼠的24 h尿量、体重和体表面积进行F检验，P均＞0.05，差异无统计学意义。

表 1

表 1 　各组幼鼠24h 尿量、体重及体表面积(x±s,n=12)

表 1 　各组幼鼠24h 尿量、体重及体表面积(x±s,n=12)

各组幼鼠尿雌三醇和孕酮Levene检验，其雌三醇、孕酮浓度及24 h尿雌三醇、孕酮均方差齐性(P均＞0.05)。妊娠奶牛奶、市售牛奶和对照组F检验，其24 h尿雌三醇和孕酮差异均有统计学意义(P＜0.01)。3组数值进行两两比较(t检验)，妊娠奶牛奶和市售牛奶组24 h尿雌三醇均高于对照组(P＜0.05)，而妊娠奶牛奶组与市售牛奶组间差异无统计学意义(P＞0.05)。妊娠奶牛奶、市售牛奶和对照组尿Cr分别为(1.799±0.629)，(1.956±0.344)和(2.118±0.874)mmol/L，计算Cr/S并进行Levene检验，方差不齐性(P＜0.05)，采用KruskalWallis H检验，差异无统计学意义(P均＞0.05)。

表 2

表 2 各组幼鼠尿雌三醇和孕酮浓度及24 h 总量(x±s,n=12)

表 2 各组幼鼠尿雌三醇和孕酮浓度及24 h 总量(x±s,n=12)

随着对食物源性雌激素研究的深入，牛奶中的雌性激素越来越引起人们的关注。现代牛奶中的雌激素可能与一些成人激素相关性疾病如乳腺、卵巢和前列腺肿瘤等的发生有关^{[2, 3]}。有关摄入牛奶中的雌性激素是否会影响儿童生长发育的文献较少。Ganmaa D等^[4]的动物实验研究未发现现代牛奶对大鼠亲代和子代生殖功能有明显影响，但子代中有1例出生时即死亡，3例有骨骼异常。

本实验结果显示，妊娠奶牛奶和市售牛奶组幼鼠24h尿雌三醇和孕酮均高于对照组。这种影响可能与2种牛奶中的雌性激素有一定关系。2种牛奶均含有一定的雌性激素。现代牛奶中雌激素水平较100年前明显增加^[3]，除了奶牛品种和饲养方法与前不同外，最主要的原因可能是奶源中含有妊娠奶牛奶。妊娠奶牛血清中雌激素水平显著提高，牛奶中的雌激素也随之增加^[5]。

本实验中2牛奶组幼鼠24h尿雌三醇和孕酮比较均无统计学意义，甚至2组的24h尿雌三醇比较，P值为1，2种牛奶对幼鼠尿液的影响相似，证实了市售牛奶中可能含有相当比例的妊娠奶牛奶。

牛奶中的雌激素主要为雌酮、雌二醇和雌三醇，由于ICMA试剂所限，本次实验未能检测雌酮。Ganmaa D等检测牛奶中雌激素的含量时发现其雌酮占总雌激素的69%^[4]。对于一个全牛奶人工喂养婴儿，如饮用该类牛奶，按每日所需热卡计算，奶量约需150 ml/kg，则将有雌激素1 200和孕酮1 080 ng/kg被摄入。

妊娠奶牛奶和市售牛奶均可影响雌性幼鼠体内雌性激素代谢，但牛奶成分复杂，除含有雌性激素外，还可能含有类雌性激素样物质，促进雌性激素分泌的物质，拮抗雌性激素或抑制其分泌的物质。因此，牛奶尤其是妊娠奶牛奶影响雌性幼鼠雌性激素代谢的机制及对幼鼠生长发育的影响有待进一步研究。