中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (10): 1194-1195   PDF    
引用本文
郝慧芳, 王志钢, 李志伟. 细粒棘球蚴内蒙株疫苗侯选基因克隆及分析[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(10): 1194-1195.
HAO Hui-fang, WANG Zhi-gang, LI Zhi-wei Cloning and sequence analyse of potential vaccine gene of echinococcus granlosus strain in inner Mongolia[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(10): 1194-1195.
细粒棘球蚴内蒙株疫苗侯选基因克隆及分析
郝慧芳, 王志钢, 李志伟     
内蒙古大学生命科学学院, 呼和浩特010021
收稿日期: 2007-01-18
基金项目: 内蒙古自治区高等学校科学研究项目(NJ05041)
作者简介: 郝慧芳(1981- ),女,内蒙古四子王旗人,硕士在读,主要从事动物病原生物学研究。
通讯作者: 王志钢
摘要： 目的 为确定细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白(FABP)基因的特性并为研究其免疫功能奠定基础。 方法 根据已报道的细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白的基因序列(AY024340和AF321119)设计引物,进行FABP基因扩增。 结果 成功克隆到细粒棘球蚴内蒙株FABP基因,扩增片段为482bp;序列比对结果显示,细粒棘球蚴内蒙株FABP基因与国内株FABP基因(GenBank登录号为AY024340)序列完全一致,同源性为100%;与国外株FABP基因(GenBank登录号为AF32I119)的同源性为99%。 结论 细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白有潜在的抗原表位位点,为研究该蛋白的免疫功能及构建FABP核酸疫苗奠定了基础。
关键词： 细粒棘球蚴     脂肪酸结合蛋白(FABP)     核酸疫苗    
Cloning and sequence analyse of potential vaccine gene of echinococcus granlosus strain in inner Mongolia
HAO Hui-fang, WANG Zhi-gang, LI Zhi-wei     
College of Life Science, Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China
Abstract: Objective To further study the character of echinococcus granulosus fatty acid binding protein(FABP)gene and provide the basis for analysis of its immunological functioning. Methods The specific primers were designed according to published nucleotide sequence of echinococcs granulosus FABP gene in the genbank database(AY024340 and AF321119).The fragment of FABP gene was amplified by PCR. Results The FABP-NM gene was successfully cloned and the full length of the cloned gene was 482bp.The FABP-NM gene showed 100% homology with the Xinjiang strain in China (AY024340)and 99% homology with the foreign strain(AF321119). Conclusion Several possible antigen epitopes located in the FABP,which prov ided the basis for further studying the immunolo gical function of FABP and construct FABP nucleic acid vaccine.
Key words: echinococcus granulosus     fatty acid binding protein(FABP)     nuclec acid vaccine    

包虫病(Hydatidosis)是由细粒棘球绦虫的幼期细粒棘球蚴寄生于机体内所引起的一种人畜共患病，在我国广泛分布，并逐渐成为严重影响人群健康的公共卫生疾病。免疫预防可以切断细粒棘球绦虫的生活史链从而控制包虫病的流行，但细粒棘球蚴组织结构及其生活史的复杂性，表现为其抗原的复杂性，故目前尚无实用有效的疫苗。研究表明，细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白(FABP)是很有应用价值的疫苗侯选分子，但在不同的地理环境和宿主中，细粒棘球绦虫存在实质性的基因遗传差异[1-5]。为探讨FABP基因是否存在地理株差异，本实验克隆了细粒棘球蚴内蒙株抗原基因FABP并进行序列分析，以期为确定该基因的特性及其免疫功能奠定基础。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样本细粒棘球蚴原头蚴

取自内蒙古锡林郭勒盟屠宰场。自患包虫病羊体中取出含包囊的肝脏，无菌条件下抽取囊液，离心分离原头蚴，磷酸盐缓冲液(PBS)(pH=7.2)洗涤并经镜检后，迅速放入液氮中冷冻，带回实验室置-80℃冰箱中保存备用。

1.1.2 主要酶类及生化试剂

高保真PrimeSTARTMHS DNA Polymerase及各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、PCR相关试剂、DNA Marker(大连TaKaRa公司)；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、IPTG、X-gal及其他生化试剂(天根生化科技(北京)有限公司)；质粒提取试剂盒(上海华舜生物工程有限公司)；常规试剂均为国产分析纯级。

1.1.3 质粒及菌种

pMD19-mTOR和E.coli DH5均由本实验室保存。

1.2 方法 1.2.1 细粒棘球蚴原头蚴总DNA提取

按参考文献[6]方法提取总DNA。

1.2.2 PCR引物设计

根据已报道的细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白的基因序列(AY024340和AF321119)经Primer5软件设计分析引物并在上游引物P1的5'端加EcoRI酶切位点和GC保护性碱基，下游引物P2的5'端加Hind Ⅱ及Xba Ⅰ酶切位点和GC保护性碱基。上游引物P1：5'-GCGAATTCATGGAGGCATTCCTTGGTAC-3'下游引物P2：5'-GCAAGCTTTCTACATTACGCCACCTTTGAG-3'。

1.2.3 FABP基因扩增

以细粒棘球蚴原头蚴总DNA为模板，加入特异性扩增引物P1和P2，扩增FABP基因。(1)反应体系：50 l体系，5×PrimeSTARTM Buffer(Mg2+plus)10 l，dNTPMixture(各2.5mmol)4 l，5pmol/l的primer 1,peimer2各2l，模版DNA(60ng/l)2 l，Taq酶(2.5 U/l)0.5 l，灭菌超纯水29.5 l。(2)扩增条件：95℃ 5 min；95℃ 10 s，52℃ 10 s，72℃ 30 s，35个循环：72℃ 10 min。(3)扩增产物回收：FABP基因PCR产物目的条带的切胶回收，按回收试剂盒产品说明书操作。

1.2.4 pMD19-FABP-NM重组质粒构建与鉴定

本实验室保存的pMD19-mTOR质粒经EcoRⅠ和Hind Ⅱ双酶切后回收载体大片段，与经同样酶切的FABP基因PCR产物连接，把FABP-DNA克隆到pMD19-T载体上，得到重组质粒命名为pMD19-FABP-NM。重组质粒经PCR和酶切双重鉴定后确认正确。

1.2.5 FABP基因序列测定与分析

将含有pMD19-FABP-NM重组质粒的E.coli DH5 送上海生工生物工程技术服务有限公司测序，根据测序结果进行序列分析。FABP基因序列利用NCBI上的BLAST软件(http：//WWW.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)[7]与国内外已报道的FABP基因序列[2, 8, 9]进行比对；用DNAStarProtean软件对理论蛋白的二级结构及抗原表位进行预测。

2 结 果 2.1 细粒棘球蚴FABP基因PCR扩增结果(图 1)

图 1可见，以原头蚴总DNA为模板，P1和P2为引物扩增后，得到大小为482bp的FABP-DNA片段。

注: 1: DL2000 分子量标准; 2: 阴性对照; 3: PCR 产物; 4:PCR 产物。 图 1 PCR 扩增结果

2.2 pMD19-FABP-NM重组质粒的鉴定(图 2)

图 2可见，双酶切得到大小为482bp的片段；以质粒为模板进行PCR反应，扩增出大小为482bp的片段，表明已经克隆到细粒棘球蚴内蒙株FABP基因。

注: 1: DL2000 分子量标准; 2: pMD19- FABP- NM 双酶切产物; 3: pMD19- FABP- NM 单酶切产物; 4:λ- EcoT14 分子量标准。 图 2 重组质粒pMD19- FABP- NM的酶切鉴定

2.3 序列测定及分析 2.3.1 序列测定

测出的序列全长为482bp；序列内部349～428bp处为一段内含子；编码序列为1～348bp和429～482bp，推导开放阅读框(ORF)为399bp编码133个氨基酸。

2.3.2 序列分析

序列比对结果显示，细粒棘球蚴内蒙株FABP基因与已报道的国内株FABP基因(GenBank登录号为AY024340)的序列均完全一致，同源性为100%；而与已发表的国外株FABP基因(GenBank登录号为AF321119)的同源性为99%，外显子区域第244位上由国外株的G变为A，内含子区域第419位由G变为C，同时在351位上多出一个碱基A。预测的氨基酸序列与国内株(GenBank登录号为AAK00579和AAV67883)完全一样，与国外株只有一个氨基酸的差别，即由国外株(GenBank登录号为AAK12096)第82位上的苏氨酸Thr变为丙氨酸Ala。

2.3.3 预测FABP蛋白二级结构和表位分析

预测的脂肪酸结合蛋白的二级结构中-螺旋占69.1%、β片层占24.8%、转角(turn)占2.25％及coiq(无规则卷曲)占3.75％。脂肪酸结合蛋白有多个潜在的抗原表位位点，分别位于氨基酸序列的(8～15)、(46～56)、(70～81)和(94～102)等区段。

3 讨 论

近年研究表明，FABP是很有发展前途的寄生虫病疫苗侯选分子之一，疫苗侯选基因可以亚克隆到表达载体上表达出多种蛋白亚单位疫苗或构建成核酸疫苗，对寄生虫的感染具有免疫保护作用[10-12]。但一直以来细粒棘球蚴FABP基因是否具有地理株差异尚不清楚，我们克隆到细粒棘球蚴内蒙株FABP基因，其与已报道的FABP基因序列的同源性比对结果为99%～100％，说明FABP基因有一定的地理株差异。利用本地虫株克隆基因进而研制基因工程疫苗是当代寄生虫病疫苗研制的重要特点，该基因的克隆有利于进一步研究FABP基因的结构与功能特性，同时其编码的理论蛋白存在着潜在的抗原表位，这为研究具有地区针对性和特异性的包虫病疫苗及其免疫效果奠定了基础。

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