副溶血弧菌是一种嗜盐革兰阴性弧菌。其中血清型O3：K6自1996年首次在印度检出以来，被认为是主要的致病血清型^[1-3]。近年来，在我国由副溶血弧菌引起的食物中毒起数在细菌性食物中毒中的比例逐渐增高，已经成为沿海地区引起食物中毒的首要致病菌^{[4, 5]}，及时监测和控制其传染源，是预防和减少副溶血弧菌食物中毒的关键。近年来，脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)因其分辨力高、结果重现性好和能满足不同实验室的分型结果比较，而被推祟用于疾病的分子流行病学调查和实时主动监测^{[6, 7]}。美国疾病控制中心(CDC)以该技术为核心建立了食源性疾病分子分型监测网络(Pulse Net)，在疾病实时监测和传染源追踪方面发挥了重要作用。2004年9月中国病源性细菌分子分型网络(PudseNet China)成立，将副溶血弧菌纳入了监测网络。本研究应用PFGE技术对深圳市56株副溶血弧菌菌株之间的相关性进行分析，并建立了深圳市副溶血弧菌的DNA指纹图谱数据库。现将结果报告如下。

根据深圳市2002～2006年副溶血弧菌食物中毒暴发时间、地点、菌株血清型等特点，从各次食物中毒暴发疫情中分别选取患者肛拭分离菌株，共获得代表菌株46株；另从食品卫生监测中选择食品污染物分离菌株10株。所有菌株都按照国家标准方法进行鉴定，并用日本生研株式会社诊断血清进行分型鉴定。分子量参考标准菌株为Pulse Net中使用的沙门菌H 9812^[8]。

脉冲场电泳仪为Gene Path^TMSystem(Bio-rad)，凝胶成像系统为Bio-rad Quantity One(4.4.0)系统。Seakem Gold胶(Cambraex Bio Science Rockland)、蛋白酶K(MERCK)、限制性内切酶XbaI(NEB和NofI(NEB)。

参照美国CDC推荐的霍乱弧菌脉冲场电泳标准方法^[9],对56株副溶血弧菌进行PFGE分型。包括如下步骤：胶块的制备、裂解、洗涤，用内切酶Not酶切胶块内副溶血弧菌DNA，XbaI酶切胶块内沙门菌H9812DNA，然后加样、电泳，再对胶块进行染色、拍照，得到电泳图谱，利用软件Bio Numerics(Version3.0，Applied Maths分析电泳图谱。

(1) 46株食物中毒患者分离株中，2006年18株，2005年8株，2004年16株，2003年1株，2002年3株；其中03：K6血清型22株，O1：K25血清型6株，O4：K8为血清型4株，O1：K41，O3：K29，OUT；KUT血清型2株(OUT和KUT分别指K抗原和U抗原不可分型)，其他血清型各1株。(2)10株污染食品分离株，2005年6株，2006年4株：血清型各不相同，其中包括O3：K6，01：K25血清型各1株，OUT：KUT血清型2株，其他血清型各1株。

副溶血弧菌基因组DNA片段得到良好分离，各菌株DNA条带为15～20条。分子量最大的片段出现在约1 135kb位置，分子量最小的片段出现在约20kb位置。56株菌包含34种PFGE型，指定为P1～P34型，各种PFGE型代表DNA片段数目和大小一致的电泳图谱。图 1可见，各种PFGE型别和相应的菌株数，其中P21型包括6株，P16、P23型各5株，P19型4株，P22型3株，P6、P9、P20和P31型各2株，其余各型只有1株。通过此研究，获得了深圳市2002～2006年副溶血弧菌代表菌株的PFGE图谱数据库。

图 1

图 1 34 种副溶血弧菌PFGE分型的聚类树状图

用软件Bio Numerics对电泳图谱分析，将34种PFGE型进行聚类分析。结果可见，在90％的相似性水平，P16～P24型属于同一个群，共28株，分属O3：K6和O1：K25血清型，除1株P18型为O3：K6的血清型菌株为污染食品分离株，其余27株均为食物中毒患者分离株，各年度均有分离。各菌株PFGE图谱不超过3条带的差异，表明是2002～2006年食物中毒的副溶血弧菌优势带型。非此群内的19株食物中毒患者分离株之间的图谱存在较大差异。污染食品分离的10株有10种PFGE型，除1株为P18型外，其余菌株之间，以及与食物中毒患者株之间的图潜均存在明显差异。

本文结果显示，引起深圳市2002～2006年副溶血弧菌食物中毒的主要血清型为O3：K6，与亚洲其他国家和国内一些省市流行型别一致^[10]。血清型O1：K25和O4：K8也占一定比例。有报道指出，血清型O1：K25是O3：K6的变异型，均为流行血清型^[11]。

大部分食物中毒患者分离株的PFGE图谱属于同一群，根据Tenover等人的标准，这些菌株在遗传学上被认为是紧密相关菌株，图谱的差异是菌株发生了单个遗传事件的结果^[12]。结果表明，深圳地区2002～2006年大多数副溶血弧菌所致食物中毒暴发疫情由遗传紧密相关的克隆株引起。污染食品分离株则为遗传不相关菌株，其中1株为P18型，与引起大多数副溶血弧菌食物中毒的菌株为遗传紧密相关菌株，提示被此菌株污染的食品容易引起食物中毒暴发，需要对该食品按规定进行处理。其余9株食品分离株与食物中毒暴发菌株图谱存在明显差异，提示被这些菌株污染的食品有可能引起一些散发病例。

PFGE方法被认为是细菌分子分型的金标准，利用该方法可以快速地将来自病人和可疑食品的细菌PFGE结果进行比较，追溯致病食品源头^[13]。PulseNet China对有效地预警、处理、预防和控制我国细菌性传染病流行十分重要，可为国家的细菌性传染病的预警、监测、分析和调查服务，提高我国细菌性传染病的防控水平。本研究结果为Pulse Net China提供了深圳地区副溶血弧菌的PFGE指纹图谱，为建立深圳市副溶血弧菌分子分型监测网络打下了良好的基础，有助于副溶血弧菌的主动监测、暴发调查和传染源追踪，将为预防和控制副溶血弧菌引起的食源性疾病发挥重要作用。