尽管美国是世界上公认的食品供应最安全国家，但每年仍有上千万例疾病与食源性致病菌污染有关，因此引起消费者、相关行业及相应机构的广泛关注^[1]。美国食品与药品管理局（FDA），规定大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌等致病菌食品中不得检出^[2]。但由于食品中成分复杂，利用常规方法检测致病菌存在周期长、步骤繁琐、工作量大、准确性差等缺点，如何快速、准确地从食品中检出致病微生物已成为当前研究热点之一。PCR技术因具有快速、准确、特异、灵敏等优点^[1]，适合出入境商品和食品中检出鉴定致病菌工作的需要而备受青睐。根据所选择引物的特异性、种类，利用PCR技术检出鉴定致病菌可大致分为2类，即:通用引物（UP）PCR技术和特异性引物（SP）PCR技术，本文对UP-PCR和SP-PCR技术的进展作一综述。

1 UP-PCR技术

生物体在长期的进化中，基因组某些特定的区域非常保守，UP-PCR即是在基因组可变区两端的保守区设计引物，以细菌总DNA作为模板进行PCR扩增。基因组中所选择保守区通常以原核生物16S rDNA、16S-23S rDNA、23S rDNA、Hsp60基因等作为靶序列。采用UP-PCR检测致病菌主要包括如下几种技术。

1.1 PCR-反向点杂交（PCR-Reverse dot blot,PCR-RDB）技术

PCR-RDB是在利用通用引物PCR扩增后，以带标记的核苷酸探针与PCR产物进行杂交，检测致病菌。该技术可同时检测多种致病菌。白薇等^[3]根据原核生物16S rRNA 基因序列设计通用引物和特异性探针检测空肠、结肠弯曲菌和沙门菌，最低检出率为40cfu。Hu等^[4]根据23S rDNA设计通用引物和特异性探针可同时检测14种致病微生物，在实际样品检测中能同时检测出霍乱弧菌等9种食源性致病微生物，敏感性为10⁶～10²cfu/ml。

1.2 PCR-单链构象多态性（Single-stranded conformation polymorphism,PCR-SSCP）技术

PCR-SSCP技术是在PCR基础上，PCR产物经变性，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳。由于单链中碱基含量的不同，使PCR产物得以分开，达到检测出致病菌的目的。杨文敏等^[5]以16S rDNA作为靶基因，对PCR产物进行SSCP分析，成功的进行食源性致病菌的检测。洪帮兴等^[6]用PCR-SSCP技术以23S rDNA设计通用引物进行PCR扩增，对13种食源性感染常见致病菌扩增产物的HpaⅡ酶切片段进行SSCP分析。结果表明，13种食源性感染常见致病菌SSCP图谱变异性更大。PCR-SSCP技术作为常规细菌学检测方法的补充，可快速鉴别食物中毒致病菌，具有较明显的优势。但对混合产物不能解决多条带问题。

1.3 PCR-变性梯度凝胶电泳（PCR-Denaturing gradient gel electrophoresis,PCR-DGGE）技术

PCR-DGGE是根据目的基因保守区设计通用引物，双链PCR产物再进行变性梯度凝胶电泳，由于所扩增产物中碱基含量和位置不同，在不同浓度的变性剂条件下，DNA双链会发生解链，泳动速度降低，从而达到检测致病菌的目的。Ji等^[7]以16S rDNA设计通用引物，在60℃条件下、6.5%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，7mmol/L尿素和40%甲酰胺变性，检测到包括嗜水气单胞菌在内的6种致病菌，但并未检测混合产物。

1.4 PCR-限制性片段长度多态性分析（PCR-Restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP）技术

RFLP是利用限制性内切酶对DNA进行酶切，由于酶切位点和数量不同，可产生DNA片段长度多态性。依据DNA片段呈现的多态现象，进行种间和种内分型。RFLP技术简单、影响因素少，但当用酶消化整个基因组DNA，酶切图谱往往伴有浓重的背景，特征性酶切条带很难辨认。将PCR技术和RFLP结合可以弥补这一缺陷。傅君芬等^[8]用PCR-RFLP技术以16S-23S rDNA基因区间设计通用引物进行PCR扩增，对26种临床常见致病菌扩增产物的AluⅠ和HinfⅠ酶切片段进行RFLP分析，正确区分所检验菌株，检出率为2.5cfu，进一步为临床细菌感染诊断提供了新的科学依据。Wong等^[9]以Hsp60基因设计通用引物进行PCR，对产物进行RDB及RFLP，从38株肠细菌中检测出空肠弯曲杆菌、大肠弯曲杆菌、大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、耶尔森菌及弧菌。此技术虽然快速、灵敏，但当所检测的致病菌较多时，由于一种限制性内切酶不能区分所有致病菌，需要几种内切酶的联合使用，较费时耗力。

1.5 巢氏（Nested,N）PCR技术

N-PCR是在通用引物扩增的序列区间设计种属特异性引物，以通用引物扩增片断作为特异性引物扩增模板进行2次甚至多次PCR扩增。大肠弯曲杆菌及空肠弯曲杆菌在样品中含量少，很难用常规的检测方法检测，Bang等^[10]以16S rRNA设计2对引物，先进行UP-PCR，扩增产物1495bp，以第二对引物进行N-PCR，扩增产物833bp。此外，以马尿酸酶基因设计4条引物，先以其中2条进行PCR，扩增产物长度为1028bp，再同时加入4条引物进行N-PCR，扩增产物分别为383，645bp。利用该技术，检出敏感性达2～3cfu/ml，较常规检测方法敏感性提高十倍，检测时间由2～4周减少到1d。孙焕冬等^[11]通过N-PCR检测单增李斯特菌仅需5～6h，特异性极高，检出率达10cfu。此技术敏感性高，准确性好，已用来检测多种致病菌，但当用于检测多种致病菌时，必须进行多次巢式PCR，这增加了检出的费用与难度。

2 SP-PCR技术

与UP-PCR技术相比，SP-PCR是根据特异性基因序列设计引物进行PCR，只进行1次PCR而无需后续操作就能检测到是否有该致病菌存在。采用SP-PCR检测致病菌主要包括如下2种技术:

2.1 多重（Multiple,M）PCR技术

M-PCR是根据致病微生物间靶基因的特异性设计引物，进行PCR时，多种引物只能对相应的属、种、亚种甚至相应株的致病微生物基因序列特异扩增。Burtscher等^[12]以沙门菌的hns基因与单增李斯特菌的hlyA基因设计引物，富积培养、提取纯化DNA、M-PCR扩增检测。结果表明，沙门菌的敏感性为10cfu/ml，单增李斯特菌敏感性为100cfu/ml，检测周期由4d减少到1d。Li等^[13] 采用M-PCR检测肉制品中的大肠杆菌O157:H7、沙门菌和志贺菌，牛肉中的检测敏感性达0.2log10cfu/g，猪肉中的为1.2log10cfu/g。Kong等^[14]采用M-PCR技术成功地从海水检出6种致病微生物，这是迄今为止应用该技术检测致病菌种类最多的报道。Li 和Mustapha^[15]根据phoP基因设计特异性引物，能扩增致病性大肠埃希菌、沙门氏菌、志贺菌和柠檬酸杆菌。Martins等^[16]以碱金属蛋白酶apr基因作为模板，经特异性引物扩增后，能从冷冻的生牛奶中特异性检测出水解蛋白的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）等4种致病菌。

2.2 实时PCR（Real time,RT）

RT-PCR是检测致病微生物的一项新技术，该技术是在常规PCR基础上，应用荧光双标记探针。标记在5端的，称为荧光报告基团(R)，标记在3端的，称为荧光抑制基团(Q)。二者可构成能量传递结构，即5端荧光基因所发出的荧光可被另一荧光基因吸收或抑制。由于探针3端羟基(-OH)已被去除或封闭，不再延伸，因此，探针在无特异性PCR发生时，荧光信号不改变；当有特异性PCR扩增时，探针会因切口平移效应导致抑制作用消失，引起报告基团荧光信号增长。荧光信号伴随着PCR进行和PCR产物的增长而增长。当信号增强到某一阈值时，循环次数(Ct值)被记录下来。Ct值和起始DNA量的对数值有严格的线性关系，根据Ct值可确定起始DNA量。RT-PCR技术检测致病菌以具有快速、敏感、可重复性好，能减少人为因素等优点而备受欢迎。Fey等^[17]以沙门菌的InvA基因和16S rRNA设计引物，使用RT-PCR技术，定量的检出该菌，而且将RNA定量，避免了持家基因不表达时以DNA为标准的错误定量。Fukushima等^[18]把RT-PCR与M-PCR结合，针对17种致病微生物设计了20 对特异性引物和17支探针，通过退火温度的不同，从食品中检测到8种致病微生物，并定量。

3 小结

目前致病微生物的检测方法很多，如抗原-抗体^[19]、微量试剂盒、质谱^[20]、生物传感器等检测方法都能较快速地检测出致病微生物，但由于安全性、灵敏性、特异性等原因而难以推广。PCR技术的出现使人类快速、准确地同时检测出多种致病微生物成为可能。然而，利用PCR技术快速检测、鉴定致病菌还有一些不足之处，如一些PCR引物在3 端有很高的重叠五聚体自由能，可导致非特异性扩增；一些引物易在3末端形成稳定二聚体或形成稳定发夹环而影响PCR扩增结果。因此，合理设计PCR引物、改进PCR方法十分必要。今后PCR技术检出致病菌将向着自动化方向发展，直接上样，自动出示检测结果，进而避免人为干扰。随着科学技术的进步及研究的不断深入，相信致病微生物的检测会更精准、快速、完善。