舟山渔场是我国最大的经济鱼虾类捕捞渔场，有着广阔的海域和丰富的海产品，新鲜的海产品具有很高的营养价值和独特口味，本地居民喜欢生食或半生食此类海产品，其中副溶血弧菌(VP)污染引起的食源性疾病暴发已成为我市突出的公共卫生问题。本文分析了舟山市定海区农贸市场经济鱼虾类海产品的副溶血弧菌污染的动态分布、血清型别及毒力基因携带状况。结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品采集

根据中国CDC营养与食品安全所下发的《国家食源性疾病监测网工作手册》的要求，选择舟山市定海区的3个农贸市场，于2004～2006年的每年5，8，10月，无菌采集舟山渔场捕捞的鱼虾类样品360份，其中鱼类185份，虾类175份。样品采集后1～2 h内送达实验室检测。

1.1.2 试剂与仪器

VP诊断血清(日本生研株式会社)；VP毒力基因TDH检测试剂盒(上海宝生科技发展有限公司)；PCR仪(德国Eppendorf公司)；VITEK-32和非发酵菌鉴定卡(NFC卡)，氧化酶(Oxydase)试剂(均为法国bioMerieux公司)。碱性蛋白胨水(APW)、硫代硫酸柠檬酸盐蔗糖(TCBS)琼脂、科玛嘉弧菌显色培养基等(浙江省疾病预防控制中心)。

1.2 方法 1.2.1 副溶血弧菌定性定量分析

参照文献^[1]方法进行，分离菌株经VITEK-32鉴定为VP时，查MPN表计算VP的浓度，最低检出限为30 MPN/100 g。

1.1.2 副溶血弧菌血清分型

按文献^{[2, 3]}方法进行。用3%盐水洗下分纯菌落，经121℃高压灭菌1～2 h，离心后取沉淀物作玻片凝集试验。

1.2.3 副溶血弧菌毒力基因分析

(1) 模板制备:取增菌液100 l,12000 r/min离心5 min，弃上清液，加入100 l DNA提取液于沉淀中，振荡混匀。置100℃水浴加热10～15 min。10000 r/min 离心1 min，保留上清待用。(2) PCR反应体系:21 l,其中含Tris-Hcl、Tag酶、引物、dNTP及模板DNA，反应程序为预变性94℃ 5 min，然后按94℃ 30 s、56℃ 40 s、72℃ 90 s循环35次，最后72℃延长3 min。(3) PCR引物:耐热直接溶血素(TDH)的上游引物为 TDH-L 5-AGCTTCCATCTGTCCCTTTT-3，下游引物为TDH-R 5-ATTACCACTACCACTCTCATA-3。(4) PCR产物检测:用含0.5 g/ml溴化乙锭的2%琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增产物为382bp，以67～501bp的Marker作对照，紫外灯下观察实验结果是否有毒力基因热稳定性溶血毒素的扩增片段。TDH阳性、阴性参考菌株均为浙江省CDC收集的临床菌株。

1.3 统计分析

采用Excel 2003进行整理，SPSS 11.5软件进行统计分析。

2 结果 2.1 不同采样点鱼虾类样品中副溶血弧菌污染状况比较

3个农贸市场的样品中,副溶血弧菌阳性分离率为41.94%(151/360) ,阳性样品平均密度为2381.15 MPN/100 g。不同农贸市场的阳性率差异以及阳性密度均值差异均无统计学意义(分别²=0.49，P＝0.78>0.05;F=1.83，P＝0.17>0.05) 。

2.2 不同年份鱼虾类样品中副溶血弧菌污染状况比较

2004年阳性分离率36.67％、阳性样品平均密度1403.91 MPN/100 g，2005年为48.33％和2928.33 MPN/100 g，2006年为40.83％和2995.64 MPN/100 g。不同年份阳性分离率差异以及阳性样品平均密度差异均无统计学意义(分别²=3.45，P=0.18>0.05; F=1.60，P=0.21>0.05) 。

2.3 不同月份鱼虾类样品中副溶血弧菌污染状况比较(表 1)

不同月份阳性分离率以及阳性样品平均密度两两之间比较，差异均有统计学意义(分别²=219.04,P＜0.05； F=26.07，P＜0.05) 。

2.4 不同种类海产品中副溶血弧菌污染状况比较(表 2)

不同种类海产品的阳性分离率差异有统计学意义(²=8.44，P＜0.05) ，但阳性样品平均密度差异无统计学意义(t=1.77，P>0.05) 。

2.5 副溶血弧菌血清分型

从分离的151 株VP 中选取有 代表性的74 株VP 进行血清分型,分布于7 个O 抗原群(O₁ ～O₅ ,O₈ ,O₁₀ ) ,主要血清群集中在O₅ ,O₄ ,O₂ 和O₁ 中,占87.84 % (65/ 74) ,其中O₅ 为主要血清群,占47.3 %(35/ 74) ; O3 血清群占4%(3/74) 。

2.6 副溶血弧菌毒力基因TDH

从分离的151株VP中选取有代表性的33株试验菌进行TDH检测，检出2株TDH阳性，检出率为6.06%(2/33) ；其中31株TDH阴性血清型为: O3 3株，O4 5株、O5 23株；2株TDH阳性血清型为:O4、O5各1株，绝大多数海产品中的VP不携带TDH基因。图 1显示海产品中VP代表株及阳性、阴性参考菌株的TDH基因扩增电泳图谱，4道和5道为海产品菌株O3血清型(TDH -)；6道为O5血清型(TDH-)；7道为O4血清型(TDH-)；8道为O4血清型(TDH+)，与11道和13道的暴发分离株和散发分离株的O4血清型相比，阳性条带亮度较低。

3 讨论

本文结果显示,舟山渔场捕捞的经济鱼虾类海产品中，VP分离阳性率为41.94%,VP密度(MPN)为2381.15 MPN/100 g，有16.11%样品超过24000 MPN/100 g，表明VP污染严重，对公众健康构成一定威胁；虾类的VP分离阳性率明显高于鱼类，但两者阳性平均密度差异无统计学意义；不同月份之间分离阳性率和阳性样品平均密度有很大的季节性差异，此结果与文献^[4]报道相符。8月份明显高于其他月份，与VP食源性疾病多发季节时间一致。

8月份海产品中VP的高密度和高携带率，提示特定季节里对海产品中的VP进行危险性评估刻不容缓，而详实的海产品中VP的定量资料则是开展评估工作不可或缺的数据。舟山作为浙江省首个海产品中VP定量分析监测点，通过连续3年分季节、定点、定类、定量所获得的经济鱼虾类中VP的污染状况，为危险性评估提供人群VP暴露量信息，为政府部门制定海产品卫生安全的VP限量标准提供技术支撑。

TDH、耐热相关溶血素(TRH)是和VP致病性密切相关的基因。本文结果表明，舟山地区绝大多数海产品中的VP不携带TDH基因。有研究表明，从外环境中分离的VP菌株，其TDH和TRH的检出率极低^{[5, 6]}，但并不意味着不是食源性疾病发生的重要流行病学因素，而是外环境中存在的VP菌株复杂性的一个反映。提示检测海产品等外环境中强致病性VP还需更为敏感的检测技术，如免疫磁珠富集法、RT-PCR法等。