麻疹减毒活疫苗20世纪60年代初问世后，在世界各地广泛应用，但80年代以来发现新分离的麻疹病毒流行株的特性与20世纪50～60年代分离的麻疹病毒流行株以及目前广泛应用的麻疹疫苗株有一定的差异^{[1, 2]}，特别是病毒株的基因发生了变化，可能会影响接种疫苗的预防作用。为确定引起陕西省麻疹流行的病原毒株，探讨相关的疫苗免疫因素，我们进行了此项研究。报告如下。

(1) 2000～2005年在陕西省选择麻疹暴发或散发中出疹3 d内的麻疹病人82例，采集咽拭子标本，保存在含2％小牛血清、终浓度1000U/ml的青霉素和链霉素的基础培养液(MEM)中，-20℃冻存。(2) 2005年采集免疫史明确的麻疹病人急性期血31份，常规分离血清后-20℃冻存。(3) 2006年采集有麻疹疫苗免疫史、无麻疹发病史的疫苗免疫人群186人份(1～2岁、3～4岁、5～6岁和14岁组)、A基因组野毒自然免疫人群40人份(55岁组)，共226人份血，常规分离血清后-20℃冻存。

受泼斯埋-巴尔病毒(EBV)(Etstein-Barr virus)转化的绒猴淋巴母细胞(B95a细胞)(日本国立感染症研究所)。将咽拭子液4℃过夜后取0.5 ml接种于长成单层的B95a细胞，吸附60～90 min后弃去上清，换含2%胎牛血清的1640培养14 d，逐日观察细胞病变(CPE)和细胞液pH值，必要时换液或盲传一代。CPE达75%以上时收获冻存。

在中国疾病预防控制中心国家麻疹实验室进行。采用酚-氯仿抽提法提取麻疹病毒悬液中的病毒RNA，用引物60-1和63-1扩增N基因碳末端的516个核苷酸片段，经纯化、标记后，在ABI-3100测序仪上，自动完成序列测定和校对分析。调出Genebank 里的基因型代表株N基因COOH端450个碱基对序列，用Bio-Edit软件对这些代表株和本文分离的毒株的N基因的450个碱基序列进行对比分析，确定基因分型。

抗原为麻疹病毒减毒株沪191(S₁₉₁) 株(中国药品生物制品检定所)和本室2005年从麻疹病人咽拭子中分离出的麻疹野病毒H1基因型毒株(SX05-2，Mvi/shannxi.PCR/13.05/2) 。将毒株接种于B95a细胞，待其完全病变后反复冻融3次，离心取上清做病毒滴定。独立滴定3次且3次滴定结果波动不超过0.5Log10时，取3次平均值计算引起50%细胞出现病变的最高稀释度(TCID50) 。

待检血清56℃ 30 min灭活后从1:2开始2倍稀释至1:256，每稀释度做一孔，每孔50 l，再加入100 TCID50的等量病毒，36℃ 5％CO₂孵箱中和90 min后加入100 l B95a细胞。第5 d观察结果，抗体滴度1:2为阳性，每批试验同时做阳性、阴性血清对照和病毒滴度回滴，确定攻击病毒的范围在32～320 TCID50之间^[3]。

应用SPSS 13.0软件进行统计分析。

将82例麻疹病人咽拭子标本接种于B95a细胞，出现特殊的融合巨细胞病变，并能连续传代的有23株,对其中19株麻疹病毒进行序列测定，其N基因COOH端450个核苷酸序列与20个已知基因型参考株的对应序列做基因亲缘性分析的结果，均为H1基因型，其中2000年的3株为H1b亚型，2001年以后的16株为H1a亚型。麻疹病毒分8个基因组20个基因型，其N基因COOH端450个核苷酸在不同的麻疹野病毒之间变异程度可达>12％。H1基因型450个核苷酸和A基因型代表株Edmonston的基因差异在6.00%～7.33%；H1a和H1b的差异在2.00%～4.00%^[2]。

分析免疫史明确的31份急性期血清。结果，有免疫史的中和抗体GMT S₁₉₁株/H1野毒株＝2.09，二者差异有统计学意义(t=1.915 0，P＜0.05) ；其中血清中和抗体效价S₁₉₁株/H1野毒株4倍的占25％，而未出现H1野毒株/S₁₉₁株4倍者； 无免疫史的中和抗体GMT H1 野毒株和S₁₉₁株二者差异无统计学意义(P>0.5) 。S₁₉₁株的中和抗体GMT有免疫史/无免疫史＝2.21，二者差异有统计学意义(t=1.725，P＜0.05) ；H1野毒株的中和抗体GMT有免疫史/无免疫史二者差异无统计学意义(P>0.5) 。

表 1

表 1 麻疹病人急性期血清中和抗体水平与免疫史关系

表 1 麻疹病人急性期血清中和抗体水平与免疫史关系

1～2岁，3～4岁，5～6岁和14岁各组中和抗体GMT S₁₉₁株与H1野毒株二者差异均有统计学意义(t=8.708，3.873，5.738，5.167，P＜0.01) ，GMT S₁₉₁株/H1野毒株分别为2.17，1.41，2.04和1.77。55岁组中和抗体GMT H1野毒株与S₁₉₁株二者差异无统计学意义(t=1.963，P>0.05) 。

表 2

表 2 健康人群血清中和不同毒株抗体水平

表 2 健康人群血清中和不同毒株抗体水平

S₁₉₁株中和抗体GMT:1～2岁组>3～4岁组＝14岁组>5～6岁组>55岁组。1～2岁组最高，与其他年龄组差异均有统计学意义(P＜0.01) 。以后快速下降，各年龄组间差异无统计学意义(P>0.05) 。

H1野毒株中和抗体GMT:1～2岁组>55岁组>3～4岁组>14岁组>5～6岁组。1～2岁组最高，与55岁组差异无统计学意义(P>0.05) ，但与其他年龄组差异均有统计学意义(P＜0.01) 。3～4岁组明显下降至1～2岁组的47.18％，5～6岁和14岁组继续下降并维持在1～2岁组的36％左右，不同年龄组间差异无统计学意义(P>0.05) 。

疫苗免疫人群血清中和S₁₉₁株的GMT(49.30) 明显高于H1野毒株的GMT(26.36) ，S₁₉₁株/H1野毒株＝1.87，二者差异有统计学意义(t=11.960，P＜0.01) ，其中血清中和抗体效价S₁₉₁株/H1野毒株4倍的占26.34％，而未出现H1野毒株/S₁₉₁株4倍者。相同毒株的中和抗体GMT在城乡间、性别间差异无统计学意义(P>0.05) ，但无论是城市或乡村、男性或女性S₁₉₁株和H1野毒株中和抗体GMT差异有统计学意义(P＜0.01) 。在5～6岁和14岁组出现的S₁₉₁株较低抗体水平(抗体效价16者25例，占32.05％)血清中，有20％(5/25) 失去了中和H1野毒株抗体，H1野毒株抗体阴性率随S₁₉₁株抗体效价下降而呈增加趋势，其中2例S₁₉₁株抗体效价1:2者均为H1野毒株抗体阴性。

由于我国从2006年开始将麻疹疫苗复种时间改为1.5～2岁，在本次研究中有部分1～6岁健康人群有近8个月内麻疹疫苗再免史，结果表明，是否有再免疫史对S₁₉₁株及H1野毒株中和抗体GMT的影响差异均无统计学意义(P>0.05) ；在同一年龄组中，无论是否再免疫S₁₉₁株中和抗体GMT均高于H1野毒株，差异有统计学意义(P＜0.05) 。抗体阴性率无再免史者(H1野毒株7.79％、S₁₉₁株5.19％)高于有再免史者(H1野毒株1.45％、S₁₉₁株0) ，差异无统计学意义(²＝3.207/3.685 P>0.05) 。

表 3

表 3 近期再免疫史对血清中和抗体水平的影响

表 3 近期再免疫史对血清中和抗体水平的影响

陕西省19株麻疹病毒均为H1基因型，2000年为H1b亚组，2001年以后均为H1a亚组，说明陕西省的麻疹流行株与20世纪60年代中国的流行株比较，已发生了较大的变异，流行株由H1b转为H1a亚组提示近几年流行优势株的变化。

陕西省麻疹患者中有1次以上麻疹疫苗免疫史的占24.4％～58.0％，其原因被归结为疫苗免疫失败^[4]。但本次研究发现:(1) 有免疫史的病人急性期血清中和S₁₉₁株的GMT(56.18) 明显高于中和H1野毒株(26.90) ，其中25％中和抗体效价S₁₉₁/H14倍。提示这些患者在感染H1野毒株前体内可能含有较低水平的S₁₉₁株抗体。(2) 疫苗免疫血清抗体水平随年龄的增长下降，在5～6岁组和14岁组中H1野毒株抗体阴性率随S₁₉₁株抗体效价下降而呈增加趋势，特别是2例S₁₉₁株抗体效价1:2者，均为H1野毒株抗体阴性。提示低水平的S₁₉₁株抗体可能不足于保护H1野毒株。因此，可以认为周剑惠等发现的在中和实验中日本麻疹H1野毒株能够从较低抗体水平逃逸的现象^[5]，在自然感染中表现为H1野毒株能够突破较低水平的疫苗免疫保护。其原因可能是H1野毒株的基因漂移、病毒表面蛋白位点的变化^[6]，导致疫苗免疫血清在同一抗体水平下，能够中和S₁₉₁株，却不能中和H1野毒株。所以，陕西省的麻疹流行不排除疫苗对H1野毒株保护性不足的因素。

目前我国使用的麻疹疫苗S₁₉₁株与早代Ed株十分相似，同属A基因组，其450个核苷酸和H1基因型的基因差异在6.00%～7.33%^[6]。本研究中186例疫苗免疫血清中和S₁₉₁株的GMT(49.30) 明显高于中和H1野毒株的(26.36) ，其中26.34％中和抗体效价S₁₉₁/H14倍，与张建华等对麻疹疫苗初免儿童血清中和抗体研究的结果一致^[7]。因此认为，目前使用的麻疹疫苗免疫保护力不十分理想，迫切需要建立新的疫苗减毒株。