间二硝基苯(m-dinitrobenzene,m-DNB)主要用于染料和塑料等化学工业，在生产和使用过程中可经皮肤或呼吸道进入体内。文献报道，硝基苯类化合物诱导产生活性氧，是造成细胞损伤的主要毒性机制之一^{[1, 2]}。本实验观察了m-DNB染毒对体外培养大鼠肝细胞活性氧生成、DNA损伤和合成的变化，为探讨m-DNB细胞毒性机制提供参考资料。

1 材料与方法 1.1 主要试剂间二硝基苯

(上海试剂三厂，经北京医科大学中心实验室提纯，纯度＞99%)；邻苯二醛、硫代巴比妥酸、细胞色素C、胶原酶美国Sigma公司)；5，5-对硫二硝基苯甲酸(瑞士Fluka公司)，谷胱甘肽(德国SERVA公司)，氧化型谷胱甘肽(英国BDH公司)。

1.2 大鼠肝细胞制备和染毒

健康雄性Wistar大鼠，体重170～180g)北京大学医学部实验动物部)。肝细胞分离、培养参照文献^[3]。将制备的大鼠肝细胞分别用间二硝基苯浓度为0(对照组)，0.1，0.5和1.0mmol/L的RPM1640培养基调至所需细胞浓度，每个水平做3个平等样，染毒120min后分别测定相关指标。

1.3 观察指标和方法

丙二醛(MDA)含量的测定用硫代巴比妥酸法(TBA)；谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSC)测定采用荧光法；谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力测定为比色法；超氧阴离子自由基(O2) 检测为细胞色素还原法；羟基阴离子自由基(OH^-)检测为电子顺磁自旋捕获(ESR)法；肝细胞DNA损伤采用单细胞凝胶电泳法^[4]；细胞DNA合成情况采用氚标记胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-tdR)掺入法。

1.4 统计分析

采用SPSS 12.0软件进行方差分析。

2 结果 2.1 间二硝基苯染毒对大鼠肝细胞中MDA水平、GSSG/GSH比值、GSH-PX活性、O2和OH^-含量影响(表 1)

间二硝基苯染毒后大鼠肝O2、OH^-和MDA随染毒增加而明显增加(P＜0.01) ，0.5和1.0mmol/L 间二硝基苯染毒组大鼠肝细胞GSSG/GSH-Px比对照组明显增加，差异有统计学意义(P＜0.05或0.01) ，以上指标均呈现较明显的剂量-效应关系。

2.2 间二硝基苯对大鼠肝细胞DNA断裂损伤和DNA合成的影响(表 1)

采用单细胞凝胶电泳法分析可见，间二硝基苯染毒大鼠肝细胞的DNA操作程度和DNA损伤细胞百分率随间二硝基苯染毒剂量增加而显著增强(P＜0.05或0.01) ；细胞³H-TdR掺入量则随间二硝基苯染毒剂量增加而明显降低，其中0.5和1.0mmol/L 间二硝基苯剂量组细胞³H-TdR掺入量明显低于对照组(P＜0.01) ，以上指标均呈现较明显的剂量-效应关系。

3 讨论

硝基苯类化合物可通过诱导氧自由基的产生，进而引起脂质过氧化反应导致细胞和组织的损伤^{[1, 2]}。本实验结果显示，间二硝基苯染毒大鼠肝细胞O2、OH^-和MDA、GSSG/GSH、GSH-PX明显增高，DNA损伤明显增强、³H-TdR掺入显著降低并均呈较明显的剂量-效应关系。结果表明，间二硝基苯可诱导自由基产生和脂质过氧化反应，进而导致细胞DNA损伤，同时具有较明显DNA合成抑制作用，这在某种程度上可干扰DNA损伤的修复，增强了间二硝基苯的基因毒效应。 GSH具有保护细胞膜免受氧化损伤的作用。本实验结果显示，随间二硝基苯染毒剂量的增加，大鼠肝细胞GSSG/GSH逐渐升高，这主要是因为间二硝基苯诱导细胞产生的活性氧消耗GSH并将其转化为GSSG，从而使GSSG/GSH升高，这也从另一个方面证实了间二硝基苯可诱发氧化应激反应，以上结果与文献报道相符^[4]。GSH-Px可催化GSSG转化为GSH，在氧化应激防御中发挥重要作用，随间二硝基苯染毒剂量增加，细胞中GSH-Px活力也随之增加，这可能是机体对间二硝基苯诱导压力的一种应激性防御反应。

总之，间二硝基苯除了与其他硝基苯类化合物具有相同的诱导活性氧生成外，还具有明显的DNA损伤和合成抑制效应。因此，间二硝基苯的基因毒性除与其诱导的DNA氧化损伤外，还可能与其抑制细胞DNA合成和修复有关。