Cdc25B蛋白家族是苏氨酸/酷氨酸(Thr/Tyr)双特异性蛋白磷酸酶，能去除14/Thr和Tyr的抑制性磷酸化修饰，推动细胞进行减数分裂。哺乳动物中存在3种形式的Cdc25蛋白，即Cdc25A，B和C。发挥磷酸酶活性的催化结构域均位于保守的羧基端，三者在N末端区域存在差异，在细胞周期调控中发挥不同作用^{[1, 2]}。根据生物信息学辅助分析提供的线索，在小鼠卵母细胞减数分裂恢复过程中，Cdc25B为蛋白激酶A(PKA)的候选底物。本实验通过构建生物型N末端缺失286氨基酸的Cdc25B表达载体，在原核细胞中表达及纯化，以探讨Cdc25B是否为PKA的直接作用底物。

PBSK-Cdc25B(Tony Hunter教授，The Salk institute惠赠)；克隆载体PGEX4T-2(美国Promega公司)；JM109(日本TaKaRa公司)；BL21(北京天为时代公司)。限制性内切酶BamH1,XhoI,TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，DNA快速纯化/回收试剂盒，质粒DNA纯化试剂盒(日本TaKaRa公司)；LURIA BROTH SASE(LB)培养基(美国Gibco公司)；谷胱甘肽转移酶(GST)抗体、辣根过氧化物酶偶连的羊抗兔IgG(美国Santa Cruz公司)；基因扩增值(BIOER，抗州博日科技有限公司)；紫外分光光度仪(美国Pharmacia公司)；电泳仪，电泳槽(美国BIO-RAD公司)；超净工作台(苏州净化设备厂)；细菌培养箱，空气浴振荡器(哈尔滨东明医疗仪器厂)。

(1)目的基因的扩增：根据小鼠Cdc25B的cDNA序列，引入计算机Primer5.0软件优化设计出上下游引物(A，B)，同时在5'端引入BamHI酶切位点，3'端引入XhoI酶切位点。引物序列如下：上游引物A：5'TCGGATCCGGTAATGGAGAACCTCATTAGTGC3'；下游引物B：5'TCTCGAGCCTCATCACTGGTCTTGCAGCCTG3'；所用引物为日本TaKaRa公司合成，以质粒PBSK-Cdc25B为模板进行PCR扩增，预计扩赠的片段为888 bp。PCR产物经1%琼脂糖电泳，凝胶回收试剂盒回收，-20℃保存备用。(2)目的基因与T载体的连接：参照试剂盒说明书。应用质粒提取试剂盒提取PGEM-T-Cdc25B质粒并用BamHI和XhoI进行双酶切鉴定，1%琼脂糖电泳溴化乙锭(EB)染色，紫外透射仪上观察结果，筛选出阳性克隆用于表达载体的构建。(3)表达载体PGEX4T-2-Cdc25B的构建及鉴定：经鉴定与T载体连接的阳性克隆和PGEX载体经BamHI和XhoI双酶切后进行连接反应^[3]。将连续反应液转化感受态BL21，进行质粒提纯，双酶切电泳及DNA测序鉴定得到正确的PGEX4T-2-Cdc25B融合表达载体。

将转化有PGEX4T-2和PGEX4T-2-cdc26B的NL21(DE3)菌株于LB培养基中(含氨苄100mg/ml)30℃，220 Rpm摇床培养2 h左右，当菌浓度A₅₅₀为0.5~1.0之间时，加入异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1.0mmol/L继续培养7h，10000r/min 4℃离心10min，收集菌沉淀，-20℃保存。

在样品中加入2倍蛋白上样缓冲液，混匀，煮沸10 min，用1%分离胶，4%浓缩胶进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，再将聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜上，抗免GST抗体为一抗(稀释比1∶1000)，羊抗兔IgG为二抗(稀释比1∶2000)，加强化学发光法曝光成像。

Cdc25B DNA片段以PBSK-Cdc25B质粒为模板，扩增出预计长度约为900bp的Cdc25B DNA片段，扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，在约900bp区域可见1条强荧光带，证明PCR成功。

图 1

1：Marker DL2000l；2:PCR产物。 图 1 PCR 扩增N 末端缺失286 年氨基酸的Cdc25B

PCR扩增出的Cdc25B基因经T-载体连接后，经BamHⅳ和Xhoⅳ双酶切后克隆到经相同酶切处理的PGEX载体后，连接产物转化BL21感受态菌，涂板培养挑取阳性克隆进行双酶切鉴定。图 2可见，给4000 bp的载体带及900 bp区域的目的带，符合预期大小，证明亚克隆成功。获得PGEX4T-2-Cdc25B用于原核表达。

图 2

1: 质粒双酶切后; 2: Marker DL15000。 图 2 PGEX4T-2-Cdc25B 经BamHⅳ 和Hhoⅳ双酶切后的电泳图谱

诱导表达的蛋白产物经Western blot分别显示相对分子量为53KD(融合蛋白)和27DK(空载体)的蛋白谱带，与预期一致。

脊椎动物卵母细胞的成熟机制一直深受关注。近来发现，PKA通过抑制减数分裂早期信号事件阻断卵母细胞成熟，但PKA的激酶活性是抑制Cdc25B活性所必需的^[4]。尽管已有研究显示，卵母细胞自发性减数分裂受多种信号系统调节，但PKA的直接作用底物及其维持减数分裂的机制尚不清楚。

图 3

1: PGEX4T-2-Cdc25B; 2: PXGE4T- 2。 图 3 重组PGEX4T- 2-Cdc25B 与PXGE4T-2经IPTG 诱导后Western blot 结果

体内实验已经证实，Cdc25B能促进卵母细胞成熟，其突变体Cdc25Bs321A能完全解除PKA的抑制，完成减数分裂。PKA可能通过磷酸化Cdc25B的321位丝氨酸抑制Cdc25B的活性进而发生G2期阻滞^[5]。但该作用是直接还是间接尚待证实。为此，我们进行PGEX4T2-Cdc25B融合蛋白的原核表达。由于原核表达系统常受目的基本本身的结构特点，转录水平的调节和蛋白水平等多因素影响^[6]，使得目的基因在原核表达系统的表达成为基因工程技术的重要环节和难点之一。

本实验中，采用商品化的GST融合表达载体PGEX4T-2，PGEX4T-2是一种较为高效的蛋白表达载体，同时表达产品可通过亲和层析法纯化，操作简单，用凝血酶即可进行酶切除去GST，进而获得所需要的蛋白产品。在蛋白大量表达前我们优化了表达条件、包括温度、诱导物浓度、诱导时间等。结果通过Wentern Blot证实获得了分子量约为53KD的融合蛋白，同时分子量约为27KD的GST载体蛋白也成功表达。下一步，准备大量表达重组蛋白，而后纯化、酶切除去载体蛋白，获得目的蛋白。在体外通过体外磷酸化实验验证Cdc25B是否为PKA的直接作用底物。