伏马菌素(fumonisin，FB)是近年来新发现的一组真菌毒素^[1]，到目前为止，发现的FB有11种，其中FB₁是污染玉米的主要成分，也是导致毒性作用的主要原因。研究证明，FB₁可引起马脑白质软化病(ELEM)和猪肺水肿综合征(PPE)。流行病学资料显示，人类膳食中FB₁污染与食管癌高发有一定关联。国际癌症研究中心把FB划分到2B组，即人类可能的致癌物。用于分析粮食中的FB₁的仪器方法虽具较高的灵敏度和特异性,但需复杂的提纯净化步骤和较贵重的仪器设备,不易推广使用^[2]。而应用单克隆抗体或多克隆抗体的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法，则具备简单、快速、灵敏的特点，并可同时检测大量样品。国外报道有抗FB₁的ELISA试剂盒，但价格昂贵。本研究研制了具有我国自主知识产权的FB₁ ELISA试剂盒，可为我国进行玉米及玉米制品中FB₁的污染情况调查及制定国标FB₁建议值等提供技术支持。

CO₂培养箱(美国Queue公司)；超净工作台(北京半导体设备一厂)；酶标分析仪(美国SUNRISE公司)；电子分析天平(瑞士Mettler公司)；低温高速离心机(德国Hermle公司)；电泳仪(美国BIO-RAD公司)；酶标板(96孔，美国Corning公司)等。伏马菌素B1(fumonisin，FB₁)、抗体亚类测定试剂盒(美国Sigma公司)；RPMI1640培养基、HEPES、福氏佐剂、二甲基亚砜等(美国Gibco公司)；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG免疫球蛋白(北京中山生物技术有限公司)；实验所用其他试剂均为分析纯以上(北京化学试剂公司)；玉米盲样(美国VICAM公司)。

(1)包被液：0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，pH 9.6。(2)洗涤液：PBS-T，即含0.05%Tween20的0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)(V/V)。(3)底物缓冲液：0.1mol/L柠檬酸加0.2mol/L磷酸氢二钠，pH5.0。(4)底物溶液：10mg 3 3'5 5'-四甲基联苯胺加入1ml二甲基甲酰胺，冷冻保藏。用时取此溶液75µl，加10ml底物缓冲液和10µl H₂O₂。(5)终止液：2mol/L H₂SO₄。(6)抗体稀释液：含0.1%(w/v)小牛血清白蛋白(BSA)的0.05mol/L PBS。(7)酶标二抗：1:5000辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG免疫球蛋白。(8)抗体：1:3.0×10⁶抗FB₁单克隆抗体。(9)FB₁标准溶液：将FB₁溶于乙腈水(V:V,50:50)中，配成1mg/ml作为储备液，4℃保存。ELISA校正曲线使用的1.0~2000.0ng/ml标准液由上述溶液用甲醇-PBS(v:v,10:90)新鲜配制。

分泌抗FB₁毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株由本室建立。BALB/c小鼠购自军事医学科学院实验动物研究所动物繁育场。采用动物体内诱生单克隆抗体的方法制备抗体。采用饱和硫酸铵法对腹水进行纯化^[5]。抗体的免疫球蛋白类别及亚类鉴定采用抗体亚类测定试剂盒。抗体蛋白含量采用BCA蛋白分析试剂盒进行测定。抗体分子量采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法^[6]。抗体亲和力的测定采用间接非竞争性ELISA法^[7]。抗体的特异性和抗体的灵敏度测定采用间接竞争抑制性ELISA法。

研磨玉米使其90%可通过250~500µm网筛。称取5g加到100ml具塞三角烧瓶中，加入1.25g NaCl及25ml甲醇水溶液(v:v，80:20)，强力震荡3min，经滤纸过滤。滤液用1%NaCl稀释10倍进行检测。

(1)用FB₁-BSA(0.125µg/ml)包被酶标微孔板，每孔120µl，4'℃过夜；(2)包被好的酶标板用PBS-T洗1×3min后，用0.2%BSA封闭，每孔200µl，4℃过夜；(3)酶标板用PBS-T洗3×3min后，加入不同浓度的标准溶液或样品提取液和单克隆抗体溶液的混合液100µl(该混合液为FB₁毒素标准液或样品提取液与单克隆抗体溶液按1:1比例混合)，37℃，90min；(4)酶标板用PBS-T洗3×3min后，加入酶标二抗，每孔100µl，37℃，50min；(5)酶标板用PBS-T洗5×3min后，加入底物溶液，每孔100µl，37℃，15min；(6)加入终止液，每孔50µl，于450nm处测定吸光度(A)值。(7) 计算公式：样品中FB₁含量(ng/g)=CDX/W。式中：C-酶标板上测的FB₁浓度(ng/ml)，根据标准曲线求得；D-样品提取液的体积，ml；X-稀释倍数；W-样品重量，g；按上述操作步骤，5g样品加入25ml提取液，则公式可写成：样品中FB₁含量(ng/g)=5CX。

(1)检出限(灵敏度)和专一性(特异性)：同抗体的特性鉴定。(2)稳定性试验：采用37℃加速破坏实验进行研究。将试剂盒放置于37℃，每隔24h进行ELISA测定，测定阴性对照(不加毒素设为B0)和阳性(即50%的抑制毒素浓度设为B)的A值，计算两者的比值A_B/A_B0。当A_B0<0.6，或A_B/A_B0>0.7时，即可判定ELISA试剂盒已失效。37℃下的24h相当于常温下的45d。(3)回收率试验：做3个水平(根据试剂盒的检测范围确定加标浓度)、6个重复的回收率试验。回收率(%)=[新样品(加标)测定值-原样品测定值]/已知加标量×100%。(4)方法的重复性：即实验室内的变异程度，对3个水平6个重复的回收率测试的结果进行变异系数的计算。(5)方法的再现性：即实验室间的变异程度，3个实验室分别做3个水平6个平行样品回收率测试实验，计算实验室间的变异系数。(6)试剂盒与高效液相色谱(HPLC)方法验证：使用该试剂盒对FB₁玉米盲样进行检测，并同时用HPLC方法进行验证。

抗体的亚类为IgG₁、分子量150KD、杂交瘤细胞产生的腹水稀释度为1:2.0×10⁸、亲和常数为6.72×10⁹L/mol。FB₁的最低检出浓度为5ng/ml，校正曲线的线性范围50~500ng/ml，线性方程Y=-0.582X+1.793(r=0.99,P<0.05)。

(1)灵敏度和特异性：最低检出浓度为51ng/ml，样品的最低检出量为250ng/g。与参试毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、T-2毒素(T-2 toxin)均无交叉反应，特异性较好。(2)稳定性：连续7d的稳定性实验结果显示，37℃第6d的B/B0值>0.7，因37℃下的24h相当于常温下的45d，试剂盒在常温状态有效期可保持225d(7.5个月)。ELISA板的条间变异系数为3.94%，行间变异系数为0.73%，总变异系数为5.78%，均符合试剂盒的要求(条件变异系数<10%，总变异系数<20%)。(3)回收率测定：进行50，200和500ng/ml 3个加标浓度的回收率实验，回收率在71.89%~112.95%之间，平均回收率为100.23%，变异系数为14.21%。(4)重复性：3个加标浓度的回收率的变异系数分别6.02%，12.97%和6.88%。结果显示，本试剂盒重复性较好。(5)再现性：3个实验室所进行的50，200，500ng/ml 3个加标浓度6个平行样品的检测结果显示，变异系数分别为15.51%，16.73%，9.76%。

分别使用试剂盒(ELISA)和HPLC方法对盲样进行检测。2种方法检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。

表 1

表 1 样品不同方法检测结果(µg/g)

表 1 样品不同方法检测结果(µg/g)

自从1988年Gelderblom等首次发现并分离出FB以来，FB₁广泛受到各国政府和学者的关注，已成为继黄曲霉毒素后的又一真菌毒素研究热点。世界范围污染调查显示，玉米污染FB₁的状况十分严重。我国迄今为止还没有开展过全国性的粮食中FB₁污染状况调查。国内外学者主要是针对我国食管癌高发区进行的污染调查。结果显示，我国食管癌高发区的玉米中FB污染状况很严重，但尚不能代表全国的污染状况。研制具有我国自主知识产权的FB₁ELISA检测试剂盒，对开展全国性FB污染调查及制定粮食中推荐限量标准建议值具有重要意义。本文在获得抗FB₁单克隆抗体的基础上，研制的FB₁的间接竞争抑制性ELISA检测试剂盒，其最低检出浓度为5ng/ml，样品的最低检出量为250ng/g，可以与国外同类试剂盒灵敏度相媲美。因无法得到FB2、FB3等FB各亚类纯品，故无法进行各亚类之间交叉反应实验，只进行了与镰刀菌属的霉菌产生的DON、ZEN、T-2毒素的交叉反应，结果显示，与之均无交叉反应，特异性较好。该试剂盒回收率在71.89%~112.95%之间，并通过实验室内、实验室间及仪器法验证。可在常温状态下保存225d，适合基层单位和现场筛查使用。