中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (8): 968-969   PDF    
引用本文
李素云, 贺性鹏, 邓暑芳, 万炜, 范松青. 甲基叔丁基醚对大鼠小脑γ-氨基丁酸影响[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(8): 968-969.
LI Su-yun, HE Xing-peng, DENG Shu-fang, , , et al. Effect of methyl tertiary butyl ether on γ-amino-butyric acid in cerebral of rat[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(8): 968-969.
甲基叔丁基醚对大鼠小脑γ-氨基丁酸影响
李素云1, 贺性鹏2, 邓暑芳2, 万炜1, 范松青1     
1. 南华大学医学院解剖学教研室, 湖南 衡阳 421001;
2. 南华大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生教研室
收稿日期: 2006-11-12
基金项目: 湖南省卫生厅科研项目基金(B2005090)
作者简介: 李素云(1972- ),女,湖南邵东人,讲师,硕士,主要从事神经毒理学研究.。
通讯作者: 贺性鹏
摘要： 目的 研究甲基叔丁基醚(Methyl tertiary butyl ether,MTBE)对大鼠小脑皮质神经递质γ-氨基丁酸(γ-GABA)的影响,探讨MTBE对中枢神经系统的急性系作用机制. 方法 54只健康成年SD大鼠,体重180~220g,随机分为9组,腹腔注射染毒,染毒剂量分别为0,700,1050,1400mg/(kg·bw).观察各染毒剂量及染毒后0.5,1,2,4,8h时MTBE对大鼠小皮质神经递质GABA的影响. 结果 MTBE对小脑皮质神经递质GABA的作用其阳性产物相对灰度值结果显示,不同剂量[700,1050,1400mg/(kg·bw)]MTBE染毒后小脑皮质神经递质GABA相对灰度值随着染毒剂量增加而增加,存在剂量-效应关系;MTBE对小脑皮质GABA的影响在染毒后0.5h时GABA表达开始增加,1.0h达到高峰,2.0h时开始减弱,8.0h时GABA表达恢复到正常水平. 结论 MTBE对中枢神经系统急性毒作用与神经递质GABA含量的改变有关.
关键词： 甲基叔丁基醚     小脑皮质     γ-氨基丁酸    
Effect of methyl tertiary butyl ether on γ-amino-butyric acid in cerebral of rat
LI Su-yun, HE Xing-peng, DENG Shu-fang,     
1. Department of Anatomy, Medical School of University of South China Hengyang 421001, China;
2. 123
Abstract: Objective To explore the acute toxic mechanism of methyl tertiary butylether(M T BE),in the cerebellar cortex by detecting the change of the neuro transmitter C-amino-but yric acid(GABA). Methods 54 adult SD rats were randomly divided into control and eight experiment groups.The MTBE exposed doses were 700,1 050,1 400mg/(kg·bw) and the control group was used normal saline 1 400 mg/(kg·bw)respect ively injected by abdo minal cavity.Then the relative grey value of GABA expressio n was mensurated after exposed MTBE in 0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 h in cer ebellar cortex. Results The expression of the GABA in cerebellar cortex was inceased when exposed MTBE[700,1 050,1 400 mg/(kg·bw)].The expression of the GABA in cerebellar cortex was changed in the different time(0.5,1.0,2.0,4.0,8.0 h)after being exposed to M T BE(1 050 mg/(kg·bw)).T he expression of the GABA began to increase in 0.5 h,reached peak in 1.0 h,began to reduce in 2.0 h,and was recovered to normal level in 8.0 h. Conclusion The acute toxic effect of MT BE in central nervous system is relevant to the neurotransmitter GABA.
Key words: methyl tertiary butyl ether     cerebellar cortex     C-amino-butyric acid    

甲基叔丁基醚(Methyl tertiary butyl ether,MTBE)是无铅汽油的添加剂，具有较强的挥发性。由异丁烯和甲醇化合而成的无色透明液体。现已广泛替代四乙基铅用作汽油防爆剂[1]。研究表明，MTBE对动物不同组织、器官、系统具有一定的急慢性毒作用，特别是对中枢神经系统具有明显的抑制毒性作用，但其作用机制尚不清楚。本实验通过MTBE对实验大鼠进行急性染毒，应用免疫组织化学方法观察MTBE对小脑皮质神经递质γ-氨基丁酸(GABA)的影响，从而了解MTBE对中枢神经系统的急性毒作用作用机制。

1 材料与方法 1.1 试剂与仪器

MTBE(湖南长岭煤油厂)，纯度为98.7%；ⅳ抗为兔抗鼠GABA IgG多克隆抗体(武汉搏士德公司)。 II抗为生物化羊抗兔(北京中山生物有限公司)。生物素-卵白素-辣根过氧化物酶复合物(ABC)(美国Sigma公司)。小牛血清(北京中山生物有限公司)。Motic 5000型荧光显微镜(美国Motic company)。图象分析系统(motic images advanced 3.2)。恒低温切片机(美国Therdo electron公司)。SD大鼠(中南大学实验动物部)。

1.2 动物实验分组

成年SD大鼠54只，体重180~220g，随机分为9组，每组6只，雌雄各半。MTBE染毒途径为腹腔注射，MTBE染毒浓度为700，1050，1400mg/(kg·bw)3个实验组；同时1050mg/(kg·bw)MTBE染毒组按染毒后不同时间(0.5，1.0，2.0，4.0，8.0h)设5个实验组；另设1个对照组，对照组注射等量生量盐水。

1.3 脑组织的固定和切片

大鼠经腹腔注射MTBE［700，1050，1400mg/(kg·bw)］染毒，实验组和对照组分别用10%水合氯醛［0.2ml/(50g·bw)］处理。用穿刺针经心尖刺入左心室至主动脉根部，右心耳剪一小口，先用温生理盐水500ml灌注，再用4℃预冷的4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液(0.1mmol/L PBS pH=7.4以下同)150~200ml灌注，取脑组织标本，在4℃预冷的4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液(0.1mol/L PBS)中后固定2~4h后，分别置于15%和30%蔗糖(0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制)溶液中至标本下沉。取小脑冰冻切片机连续冠状切片，片厚30µm,0.01mol/L PBS 6孔反应板接片待用。

1.4 免疫组织化学(ABC法)

切片(隔5张取1张)用0.01mol/L PBS冲洗5min，3次；室温下3%H2O2浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶；0.01mol/L PBS冲洗5min，3次；0.3% Tritonx-100浸泡30min；0.01mol/L PBS冲洗5min，3次；5%羊血清室温下封闭1h；1∶200 GABA兔抗鼠多克隆抗体4℃冰箱过夜；0.01mol/L PBS冲洗5min，3次；1∶200生物素化羊抗兔室温孵育2.5h；0.01mol/L PBS冲洗5min，3次；滴加1∶200 ABC复合物(提前0.5 h配制)，室温孵育2 h；0.01 mol/L PBS冲洗5 min，3次；滴加0.05% DAB和0.03%H2O2显色5min；0.01mol/L PBS终止反应，贴片，常规脱水，透明，中性树胶封片。对照实验采用0.01mol/L PBS代替一抗，其余步骤相同。

1.5 显微照相及图像分析

每只动物各取8张染色切片，每个部位取2张切片，在相同条件下，用美国Motic公司Images advanced 3.2图像采集系统采集图像并进行分析，测定观察部位的灰度平均值(灰度即图像的深浅程度，系统数字化图像的范围为0~255。阳性反应产物越深，灰度值越小，而相对灰度越大)。各组之间取同侧相同部位的相对灰度平均值进行比较。

1.6 统计分析

用SPSS 13.0统计软件对各组相对灰度平均值进行单因素方差分析。

2 结 果 2.1 MTBE对小脑皮质神经递质GABA的影响

在小脑皮质内梨状细胞层细胞为GABA能神经元细胞，GABA是一种氨基酸类抑制性神经递质，存于神经元细胞的胞浆内，GABA阳性神经元细胞表现为胞浆着色为主。免疫组织化学方法DAB显色，神经元细胞胞浆呈棕黄色，当DAB加强显色时，呈紫蓝色。大鼠经不同剂量［700，1050，1400mg/(kg·bw)］MTBE染毒后小脑皮质神经递质GABA相对灰度平均值分虽为(40.0±5.7)，(58.4±10.6)，(71.9±10.5)，(113.4±10.4)。结果表明，随着染毒剂量增加，GABA神经递质含量明显增多。染毒剂量为700mg/(kg·bw)时神经元细胞胞浆呈棕黄色，当染毒剂量为1050,1400mg/(kg·bw)时加强显色时神经元细胞胞浆呈紫蓝色，呈明显的剂量-效应关系(图 1)。

图 1 MTBE 对小脑皮质神经递质GABA 的影响( 10×40)

2.2 MTBE染毒后不同时间小脑皮质神经递质GABA表达的变化

MTBE 1050mg/(kg·bw)染毒后，不同时间小脑皮质神经递质GABA阳性产物相对灰度平均值实验结果表明，染毒后0.5h时GABA的表达开始增高，其阳性神经元表达增强，胞浆着色加深，相对灰度平均值增高；在染毒后1.0h时达到高峰，GABA阳性神经元表达减弱，胞浆着色变浅，相对灰度平均值降低，至染毒后8.0h时GABA的表达降至正常水平。MTBE染毒后0.5~2.0h与对照组比较，GABA含量相对灰度平均值差异有统计学意义(P<10.01)，染毒后8.0h与对照组比较，GABA含量相对灰度平均值差异无统计学意义(P>0.05)(表 1)。

表 1 MTBE染毒后不同时间对小脑皮质神经递质GABA 的影响(n= 6,…x±s)

3 讨 论

MTBE作为一种新型的汽油添加剂。许多研究已经表明，它对机体多系统具有急慢性毒作用[1, 2]。研究显示，MTBE的神经毒性表现为明显的中枢抑制作用。Martin JV[3, 4]研究MTBE对大鼠大脑皮质GABA(A)受体的影响结果提示MTBE具有神经毒性。人群接触低浓度MTBE出现头痛、眩晕、恶心等现象，高浓度MTBE可引起实验动物产生麻醉作用。大鼠吸入MTBE染毒后可出现瞳孔变小、运动失调、鸭状步、后肢握力下降等表现，急性中毒严重者出现死亡[5, 6]。本实验过程中同样观察到MTBE使实验动物出现运动平衡失调、鸭状步等小脑功能改变症状。

γ-氨基丁酸(GABA)作为典型的抑制性神经递质，由脑内含量极高的谷氨酸经谷氨酸脱羧酶(GAD)作用脱羧而成，广泛存在于脑组织中，主要集中在灰质内，且存在于神经元细胞的胞浆内，具有合成和降解的酶系统，可直接从胞浆释放到突触间隙发挥作用。对维持神经细胞兴奋和抑制功能平衡的稳定具有极为重要的作用[7]。

结果发现，各个不同时间点均可见到GABA的阳性细胞，其相对灰度值定量结果表明随着染毒剂量增加，GABA含量明显增多；同一剂量随着染毒时间不同，GABA含量也不同，染毒后0.5h时GABA表达开始增高，大鼠出现功能抑制；染毒后1.0h时GABA表达达高峰，抑制最明显；染毒后2.0~4.0h时GABA表达下降，大鼠开始活跃，抑制功能逐渐恢复；染毒后8.0h时GABA表达降至正常。MTBE对GABA具有时间-效应、剂量-效应关系。本实验结果提示，抑制性神经递质GABA增加，是MTBE对中枢神经抑制的重要原因。

参考文献
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