有资料表明，我国有近30%以上的城市儿童受到不同程度的铅损伤^[1]，其中相当多是由于母体铅负荷造成的，而我国育龄期妇女血铅浓度超过100µg/L者近20%^[2]，因此，母体铅暴露影响儿童智力水平及其机制的研究具有重要意义。本室前期研究发现，妊娠期母鼠通过自由饮水接触低水平铅，可以明显影响子代的学习记忆能力^[3]。本研究观察了子代大鼠海马部位星形胶质细胞及其胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)表达的变化，分析这种变化与学习记忆能力减退的关系，旨在探讨铅暴露对子代学习记忆能力影响的分子机制。

醋酸铅，优级纯(美国Sigma公司)；即用型过氧化物酶标记的链霉卵白素(SP)免疫组化工作液试剂盒(北京中山生物技术公司)；一抗为GFAP兔抗人多克隆抗体，二抗为羊抗小鼠IgG；原位杂交试剂盒(武汉博士德生物试剂公司)；采用针对GFAP特异性的寡核苷酸探针，经地高辛标记。体重250~300g健康成年Wistar大鼠(河北省实验动物中心)，共32只。YL3石蜡切片机(上海仪表厂)；DK-8A水浴箱(上海医用恒温设备厂)；数码显微照相系统(德国Leica)；UFX-2显微镜(日本Olympus公司)。

动物在20~25℃、光照和黑暗各占12h的清洁环境内饲养。饲养环境、用具、饮水、饲料严格控制铅污染。按雌：雄=2：1合笼饲养。每日清晨检查雌鼠有无阴栓，阴栓不确定者作阴道涂片以确定受孕，发现阳性者为受孕1d。将孕鼠随机分为4组，每组8只，分笼饲养。处理组分别给予含醋酸铅125(低剂量组)、250(中剂量组)和500mg/L(高剂量组)的饮水，对照组(C组)给予无铅蒸馏水，自怀孕1d起自由饮用直至仔鼠出生。仔鼠出生后母鼠正常饮水、饮食，仔鼠由母鼠喂养至断乳后与母鼠分笼饲养。

在仔鼠出生1d断头处死，于冰盘上迅速剥离全脑，放入4℃4%多聚甲醛固定；21，60d仔鼠经左心室插管，4℃4%多聚甲醛灌注固定后断头，打开颅骨剖出全脑，沿冠状面方向，在视神经交叉以上及以下，将包含海马区的脑组织切下，置于4℃4%多聚甲醛后固定。mRNA取材时所用物品经焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，高压灭菌后固定。

组织固定后，常规洗涤、透明、包埋，切片，切片入10%H₂O₂室温孵育10min，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，枸橼酸缓冲液用微波炉反复烧开修复40min，自然冷却后用PBS清洗，滴加兔抗GFAP血清，室温孵育5~10min，滴加一抗工作液25µl；4℃湿盒内过夜，37℃复温45min，用PBS清洗，加二抗；37℃孵育60min，用PBS清洗，滴加三抗；37℃孵育60 min，用PBS清洗后用二氨基苯联胺(DAB)显色，脱水，透明，封片。

常规脱水、浸蜡、包埋、切片，切片入10%H₂O₂室温孵育10min，滴加胃蛋白酶37℃消化10~12min，PBS清洗，含有1/1000 DEPC/1%多聚甲醛/0.1mol/L PBS室温固定10min，加20µl预杂交液，恒温箱40℃3h，加20µl杂交液，将原位杂交专用盖玻片盖在切片上，恒温箱40℃过夜，用标准柠檬酸盐溶液(SSC)洗涤，加封闭液，滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃反应60min，PBS清洗，滴加链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物(SABC)试剂，37℃反应20min，PBS清洗，滴加生物素化过氧化物酶，37℃反应20min，PBS清洗，DAB染色，脱水，透明，封片。

显微照相用德国Leica数码显微照相系统，用Olympus显微镜对染色切片进行分析。在400倍视野下，每只仔鼠选取3张切片，每张切片选取2个视野，对海马CA1区进行观察，计数GFAP免疫组化、原位杂交反应阳性细胞的数目。

采用SPSS 11.5软件进行处理，确定方差齐后用方差分析，组间比较用q检验。

仔鼠出生后，海马CA1区GFAP阳性细胞逐渐增多，形态渐趋完整、典型，着色部位在胞浆，棕黄色，核不着色，细胞呈现出典型的蜘蛛状形态。其中1d阶段CA1区仅有少量GFAP阳性细胞，细胞突起细小而量少。21，60d阶段GFAP阳性细胞大量增加，细胞突起粗长而数多，形态完整而典型。1,21d时，铅处理组仔鼠海马CA1区GFAP阳性细胞平均数目，明显多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；在60d时差异无统计学意义(P>0.05)。在出生1d时，母鼠铅暴露剂量与仔鼠GFAP免疫组化阳性细胞数目之间，呈良好的剂量反应关系(r=0.6718，P<0.05)，至21,60d时，未见明显剂量反应关系。

表 1

表 1 母体低水平铅暴露对子代海马CA1区GFAP蛋白表达的影响(n= 8, x±s)

表 1 母体低水平铅暴露对子代海马CA1区GFAP蛋白表达的影响(n= 8, x±s)

仔鼠出生后海马CA1区GFAP mRNA阳性细胞逐渐增多，细胞着色部位主要在胞浆，反应物质呈棕黄色，围绕在核周围，着色细胞呈多角状。在1，21d时，铅处理组仔鼠海马CA1区GFAPmRNA阳性细胞数，明显多于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；在60d时，差异无统计学意义(P>0.05)。在第1d阶段，母鼠铅暴露剂量与仔鼠GFAP mRNA阳性细胞数之间，呈良好的剂量反应关系(r=0.7543，P<0.05)，21，60d时，未见明显剂量反应关系。

表 2

表 2 母体低水平铅暴露对子代海马CAl区GFAP mRNA表达的影响(n= 8, x±s)

表 2 母体低水平铅暴露对子代海马CAl区GFAP mRNA表达的影响(n= 8, x±s)

星形胶质细胞合成和分泌多种细胞因子，对神经元的生存、发育、再生、分化有重要作用^{[4, 5]}；星形胶质细胞本身具有可兴奋性，能调节释放至突触间隙的神经递质的量，并参与神经递质的代谢，来影响神经元的功能和活动^[6]。体外研究发现，星形胶质细胞能够显著增加神经元突触的数量，并维持其功能的稳定性^[7]，是神经系统进行突触功能调节必不可少的一种方式^[8]。

本室前期研究表明，母鼠在妊娠期接触较低剂量铅后，可使铅在胎鼠的海马蓄积，并影响仔鼠的学习记忆能力^[3]。Pardt等^[9]发现，将小鼠从胎儿期开始进行持续性铅染毒直至产后，其GFAP的mRNA数量和表达都有上升。体外细胞培养也表明，1µmol/L铅就可以使GFAP表达增加^[10]。本研究结果显示，在出生1，21d时，铅暴露组仔鼠脑海马CA1区GFAP的基因转录、蛋白表达都有增加，再次证明铅可以增加海马CA1区星形胶质细胞内GFAP的表达。GFAP表达增加，可以影响其自身功能以及对神经元功能的调控，而海马CA1区神经元与其他部位神经元的长时程增强具有协同性、联合性、特异性，可影响信息储存和记忆形成^[11]。因此，可以认为铅增加星形胶质细胞内GFAP的表达，可能是其影响学习记忆的机制之一。