中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (8): 944-946   PDF    
引用本文
余焕玲, 张杰, 张晓红, 向丽, 肖荣. 亚硒酸钠对神经皮质细胞氧化损伤作用[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(8): 944-946.
YU Huan-ling, ZHANG Jie, ZHANG Xiao-hong, , , et al. Sodium selenite induced oxidative damage in cultured cortical neurons[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(8): 944-946.
亚硒酸钠对神经皮质细胞氧化损伤作用
余焕玲, 张杰, 张晓红, 向丽, 肖荣     
首都医科大学公共卫生与家庭医学学院营养与食品卫生学系, 北京100069
收稿日期: 2006-11-23
基金项目: 国家自然科学基金(30571560);北京市教委人才引进启动基金
作者简介: 余焕玲(1977- ),女,河南邓州人,讲师,博士,研究方向:营养与健康.。
通讯作者: 肖荣
摘要： 目的 研究不同剂量亚硒酸钠对小鼠大脑皮层神经皮质细胞的损伤作用. 方法 选用24h龄ICR小鼠,培养大脑神经皮质细胞,48h后加入不同浓度的亚硒酸钠(0.004,0.020,0.100,0.500μmol/L),四甲基偶氮噻唑蓝试验检测细胞活性、激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位,慧星试验检测细胞DNA损伤. 结果 高剂量亚硒酸钠(0.1和0.5μmol/L)明显抑制皮质神经细胞生长、降低线粒体膜电位、并严重损伤DNA,且呈现剂量效应关系(P<0.05).与对照组比较,低剂量亚硒酸钠(0.004和0.020μmol/L)虽然呈现一定毒性作用,但差异无统计学意义(P>0.05). 结论 高浓度亚硒酸钠可引起细胞损伤,降低细胞活力,其机制可能与细胞线粒体结构和功能改变以及DNA结构损伤有关.
关键词： 亚硒酸钠     神经皮质细胞     氧化损伤    
Sodium selenite induced oxidative damage in cultured cortical neurons
YU Huan-ling, ZHANG Jie, ZHANG Xiao-hong,     
Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health and Family Medicine, Capital University of Medical Sciences Beijing 100069, China
Abstract: Objective To observe the damage of sodium selenite on cultured cortical neurons and its mechanism. Methods Sodium selenite was added to neuronal after two days cultured in vitro with different concentrations(0.000,0.004,0.020,0.100,and 0.500 Lmol/L).Mitochondr ial membrane potential(confocal microscopy throug h focusing,CMTF)and MTT were performed to investigate the alterations of mitochondrial structure and functions;DNA damage was measured by single cell gel electrophoresis(SCG E).Each experiment was repeated at least 3 times. Results High concentration of sodium selenite(0.100~0.500μmol/L)could cause significant damage of cultured cortical neurons,whereas low concentration of sodium selenite(0~0.020μmol/L)had no effect on the activity of the cells. Conclusion Our data demonstrated that high concentration of sodium selenite could damage the cultured neurons.The alterations of mitochondrial structure and functions and DN A damage played important roles in neurotox ic mechanism induced by sodium selenite.
Key words: sodium selenite     cortical neurons     oxidative damage    

硒是人体生命中不可缺少的微量元素之一，其在机体最重要的生理功能就是抗氧化性[1]。硒以其特有的浓度存在于神经系统中，保证大脑的正常发育和功能，维护神经系统的正常功能[2]。但硒的生物学效应具有双向性，即低浓度硒能提高神经细胞的抗氧化能力[3]，而高浓度硒则引起神经细胞凋亡[4]；一定条件下硒化合物可以导致活性氧产生，对细胞造成氧化损伤[5]。我们的早期研究证实，亚硒酸钠对离体皮质神经元具有致凋亡作用，且有明显的剂量和时间效应关系[6-8]。本实验在前期工作基础上，进一步观察亚硒酸钠对神经皮质细胞的损伤作用。

1 材料与方法 1.1 动物与分组 1.1.1 动物

清洁级24 h龄ICR小鼠(首都医科大学实验动物科学部)。

1.1.2 分组

神经皮质细胞培养48 h后，根据亚硒酸钠浓度的不同，分为0.000(对照组)，0.004，0.020，0.100，0.500 µmol/L组，共5组。

1.2 试剂与仪器 1.2.1 主要试剂

亚硒酸钠、琼脂糖(低熔点和正常熔点)、胰酶、碘化丙啶(PI)、3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5二苯基四氮唑溴盐、罗丹明123、二甲基亚砜(DMSO)、Triton-100(美国Sigma公司)；Dulbecco's改良的Eagle's培养基(DMEM)、马血清(美国Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青公司)；肌氨酸钠(北京拜尔迪生物有限公司)。

1.2.2 主要仪器

酶标仪(芬兰Wellscan MK3公司)；DYY-III-5型电泳仪(北京六一仪器厂)；荧光倒置显微镜(TE2000-E型,日本Nikon公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；激光扫描共聚焦显微镜(美国Leica TCS-NT公司)。

1.3 方法 1.3.1 神经皮质细胞的培养

参照肖荣等[9]的方法，略加改进。出生24 h内的ICR小鼠用酒精棉消毒后，剥离大脑背侧皮质，37℃胰酶消化、离心后加入DMEM全液制成1×105，1×106，1×107的细胞悬液，接种于预先用鼠尾胶原处理好的96孔板、平皿或培养瓶中，37℃，5％CO2培养。

1.3.2 四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)细胞活性试验

将用亚硒酸钠处理的皮质细胞加入96孔板，每孔200 µl，同浓度3个平行样，培养24 h后，每孔加入20 µl 5 mg/ml的MTT，于37℃，5% CO2条件下继续培养4 h，弃去孔内液体，每孔加入200 µl DMSO，放置10 min，混匀，在λ=570 nm的条件下用酶标仪测定吸光度(A)值。

1.3.3 线粒体膜电位检测

原代神经皮质细胞贴壁培养48 h后加入不同剂量的亚硒酸钠，染毒24 h后，分别加入罗丹明123，使其终浓度为10 µg/ml，按文献[10]方法采用激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位。

1.3.4 彗星试验

按照Singh[11]等(1988年)描述的方法进行，略加改进。具体方法如下：贴壁培养细胞用胰酶消化后加入磷酸盐缓冲液(PBS)制成细胞悬液，取25与75 µl融化好的1.0％低熔点琼脂糖混匀并制胶，另外2层胶均由100 µl 0.8％正常熔点琼脂糖制成。将整个毛玻璃放入裂解液，于4℃避光裂解1 h，解旋20 min，然后在4℃、20 V、300 mA条件下电泳25 min。染色并脱色后在荧光显微镜下观察，计数200个细胞，计算彗星细胞所占的比例以及彗尾长度。

1.4 统计分析

采用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析和x2检验。

2 结 果 2.1 亚硒酸钠对皮质细胞生长的抑制作用

结果显示，各剂量组在570 nm处的吸光度(A570)值随亚硒酸钠浓度的增高而逐渐降低，与对照组比较，0.1和0.5 µmol/L亚硒酸钠显著抑制细胞生长，A570值显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；低剂量亚硒酸钠(0.004和0.02 µmol/L)虽然对细胞生长有一定的抑制作用，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 亚硒酸钠对皮质神经细胞线粒体膜电位的影响(表 1)
表 1 亚硒酸钠对线粒体膜电位的影响(…x±s, n= 45)

用激光共聚焦显微镜检测的细胞线粒体膜电位，与对照组比较，0.1和0.5 µmol/L的亚硒酸钠显著降低(P<0.05)皮质神经细胞的线粒体膜电位，而且随着亚硒酸钠浓度的增高，呈现剂量效应关系。虽然低浓度(0.004和0.020 µmol/L)的亚硒酸钠有降低线粒体膜电位的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 亚硒酸钠对皮质神经细胞DNA的损伤(图 1，表 2)
图 1 亚硒酸钠对皮质神经细胞DNA 的损伤

表 2 亚硒酸钠对皮质神经细胞DNA 的损伤(n= 200)

不同浓度的亚硒酸钠处理皮质神经细胞以后，DNA受到不到程度的损伤，继而引发高级结构松散，在电场作用下，松散的DNA离开细胞核向正极移动，正常的细胞呈现典型的圆形，亚硒酸钠处理后，细胞有明显的拖尾现象。

结果发现，正常组拖尾细胞占总细胞数的26％，平均尾长为11.08 mm。亚硒酸钠处理后，拖尾率和平均尾长均显著增加(P<0.05)，而且呈现出剂量效应关系。

3 讨论

线粒体膜电位(Mitochondrial Membrane Potential)指生物膜两侧离子浓度不同所产生的跨膜电位差，它反映了线粒体功能和膜的完整性，是评价线粒体功能的敏感指标。在本研究中，0.1和0.5 µmol/L亚硒酸钠显著降低线粒体膜电位，显示出对线粒体功能和膜完整性的破坏作用。硒的毒性机制之一在于增加活性氧自由基(reactiveosygenspecies，ROS)的产量[5]，活性氧不仅损伤线粒体，还可直接攻击细胞DNA[4, 10]。本研究的单细胞凝胶电泳实验结果表明，亚硒酸钠显著破坏细胞DNA，使拖尾率和彗尾长度显著增加，与上述毒作用机制一致。

本研究结果证明，0.1和0.5 µmol/L亚硒酸钠对大脑皮质神经细胞有明显的损伤作用，这种毒性作用可能与线粒体结构和功能改变以及DNA的结构损伤有关。前期研究发现，亚硒酸钠可通过诱导促凋亡基因bax、p53、c-fos等表达的上调，并且诱导抑制凋亡基因bcl-2表达的下调，在相关基因表达中c-fos、bax、p53和bcl-2的变化主要与凋亡的早期事件有关，AChE基因表达的增强同凋亡发展的整个过程有关，从而达到促进皮质神经细胞凋亡的作用[12]。结果提示，亚硒酸钠不仅可以直接损伤神经细胞生存能力、线粒体和DNA，而且还可通过改变凋亡基因表达而促进细胞凋亡。有关亚硒酸钠对线粒体功能和结构损伤的分子机制还有待于进一步研究。

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