1990～1992 年全国第二次死因回顾调查资料显示,哈萨克族食管癌的调整死亡率(68.95/ 10 万) 高于其他民族,新疆是哈萨克族聚集的地区,该民族以游牧为生,饮食结构较单一,少食蔬菜水果。研究表明,叶酸缺乏与多种癌症相关,其缺乏可能通过扰乱正常DNA 甲基化、合成和修复而致癌^[1]。因此,叶酸代谢障碍可能与叶酸摄入不足有相同的生物学作用。亚甲基四氢叶酸还原酶(Methylenetetrahydrofolate reducase ,MTHFR) 是一种调节叶酸的限速酶。研究发现,MTH-FR 基因具有多态性,其中最常见的是C677T 多态,即在677位点发生C →T 改变,使酶活性显著降低,DNA 甲基化水平降低^[2]。为进一步探讨食管癌的病因,本研究对哈萨克族食管癌患者和正常人群蔬菜水果摄入情况进行调查,并进行MTHFR 基因多态性检测,综合分析蔬菜水果摄入量及MTHFR 基因多态性与哈萨克族食管癌易感性的关系。

2005 年3 月～2006 年7 月,在新疆北部哈萨克族聚集地区的6 所医院,共收集哈萨克族新发食管癌病人92例。其中80 例为病理确诊,12 例为钡餐透视诊断,按1∶2 匹配对照,一名对照来源于同一所医院的非肿瘤、非消化道疾病的就诊或住院病人,另一名对照来源于同一乡镇或市区的正常人群,共计184 人。匹配条件:同民族、同性别、年龄相差不超过5 岁、居住同一地区。详细询问蔬菜水果摄入情况,同时抽取静脉血,乙二胺四乙酸二钠盐- K₂ ( EDTA - K₂ ) 抗凝,分装,- 70 ℃低温保存。

基因组DNA 提取用上海生物工程基因组小量抽提试剂盒Ⅱ。MTHFR 基因的检测参照文献PCR -RFL P 技术检测^[3],所用引物^[3]为5′- TTTGAGGCTGAC-CTGAACACTTGAAGGAG - 3′和5′- GAGTGGTAGCCCTG-GATGGGAAAGATCCCG- 3′。PCR 反应总体积25 μl ,基因组DNA 溶液2μl ,含引物(20 pmol/μl) 各0.5μl ,2.5mmol/ L的4 ×dNTP0.5μl 、5U/μlTaq 酶0.1μl ,MgCl₂2.0mmol/ L ,10×PCR Buffer 2.5μl 。PCR 扩增条件为:95 ℃预变性5 min ,94 ℃1 min、60.5 ℃1 min、72 ℃1 min ,共35 个循环,最后72 ℃延伸8 min ,PCR 产物用Hinf Ⅰ内切酶在37 ℃消化13 h ,用2 %琼脂糖凝胶电泳、确定MTHFR 基因型。基因型分为野生型纯合型(C/ C) 、杂合型(C/ T) 、变异纯合型( T/ T) 。

采用SPSS 12.0 软件进行分析,以χ² 检验确定各基因型在病例和对照中分布的关系,采用单因素条件Logistic 回归分析,进一步做多因素分析。食用蔬菜水果的量化分级: ≤1 次/ 周为不吃或少吃; > 1 次/ 周且≤2 次/ 周为偶尔; ≥3 次/ 周为经常。

为检验人群MTHFRC677T 基因型频率是否符合Hardy - Weinberg 遗传平衡,将MTHFR 基因型频率观察值与期望值进行比较,差异无统计学意义(χ² =1.168 ,v = 2 ,P = 0.558) ,表明MTHFR 基因型频率均已达到遗传平衡,具有人群代表性。

食管癌组中MTHFR677 分布频率C/ C(野生型纯合型) 52.2 % ,C/T(杂合型) 43.5 % ,T/ T ( 变异纯合型) 4.3 % ,对照组为70.7 % ,24.5 % ,4.7 % ,各基因型频率分布2 组比较差异有统计学意义(χ² = 10.492 ,v = 2 ,P = 0.005) ,食管癌组677C/ T基因型携带者高于对照组;病例组与对照组等位基因C 和T的频率比较,差异也有统计学意义(χ² = 6.140 ,v = 2 ,P =0.013) ,等位基因T 携带者发生食管癌的危险性为C 的1.709 倍(95 %CI = 1.115～2.167) 。

用蔬菜水果摄入的情况来反映叶酸摄入水平。多因素分析显示,无论偶尔还是经常吃绿色蔬菜水果,均为食管癌的保护因素,OR 值分别为0.761 ,0.245 ,且随着摄入频次的增加,保护作用越强;677C/ T 型与C/ C 型比较,差异有统计学意义,C/ T 基因型携带者发生食管癌的危险性为C/ C 的7.216 倍(95 %CI = 1.552～33.554) ;无论是在病例组还是对照组,MTHFRC677T/ T 基因型所占比例较少,与C/ C基因型比较,差异无统计学意义,但仍具有一定的危险性。虽然MTHFRC677T 基因多态性与叶酸摄入量之间的交互作用比较,差异无统计学意义,但仍然可以看出无论是偶尔吃绿色蔬菜水果者(即叶酸摄入适中) 还是经常吃绿色蔬菜水果者(即叶酸摄入较多) 均可降低C/ T 基因型携带者发生食管癌的危险性,见表 1 。

表 1

表 1 蔬菜水果摄入情况与食管癌易感性多因素分析

表 1 蔬菜水果摄入情况与食管癌易感性多因素分析

本研究结果表明,MTHFRC677T 多态性是哈萨克族食管癌遗传易感性因素,特别是T 等位基因频率在哈萨克族食管癌组中较高,该基因变异对哈萨克族食管癌的影响明显,即在哈萨克族人群中,携带T 等位基因患者食管癌的风险性高于携带C 等位基因者。

通过蔬菜水果的摄入量间接反映叶酸摄入量来进一步研究基因与营养素的交互作用。研究表明,MTHFR 基因多态与肿瘤的关系受叶酸摄入的影响^[4]。本研究结果与之相似,当叶酸摄入充足时,携带MTHFR677 变异基因型者(C/ C +C/ T) 患食管癌的风险降低,虽然MTHFR 基因677C →T 突变使MTHFR 活性下降,但在叶酸充足的条件下,有足够的甲基供体保证正常甲基化,从而增进DNA 合成并减少DNA 损伤危险。然而,当叶酸摄入不足时,携带MTHFR 变异基因型者DNA 甲基化和DNA 合成/ 修复异常成为致癌的主要机制。本研究虽然在交互作用方面差异无统计学意义,但其变化趋势与上述结论一致。证明MTHFRC677T 基因多态与哈萨克族食管癌有关,叶酸代谢在食管癌变过程中具有重要意义。

研究显示,蔬菜是食管癌保护因素,若为MTHFR677C/ T或T/ T 基因型携带者,较高的蔬菜水果摄入量会大大降低患者食管癌的风险,由于饮食成分是复杂的,饮食与食管癌的关系也是复杂的,尤其是哈萨克族,其遗传易感性和饮食习惯与汉族人不同,所以目前难以确切地解释饮食和MTHFR基因型交互作用与食管癌发生关系的机制。但本研究结果提示,良好的饮食习惯,尤其是对MTHFRC/ T 或T/ T 基因型携带者,有预防食管癌发生的作用。