部分环境雌激素有致癌或促癌作用^[1]，近年激素替代疗法与乳腺癌的关系日益受到了广泛的关注。研究发现，孕期使用己烯雌酚(DES)的妇女其女儿阴道透明细胞癌的发生率升高。流行病学调查显示，单纯的激素替代治疗患乳癌的危险度增加^[2]；动物实验证实产前接触DES不仅对F1动物有致癌作用，对F2动物也有致癌影响^[3]。WISP-2(Wnt-linducible signaling pathway protein-2)基因是新近确定的雌激素反应基因^[4]，MCF-7癌细胞的增殖正性调节因子^[5]。雌二醇可特异诱导MCF-7细胞中WISP-2蛋白表达增加^[4]。为了解DES在诱导乳腺癌中与WISP-2基因及其蛋白表达关系，本文以雌二醇为比照，研究环境雌激素DES对MCF-7细胞中的WISP-2基因表达的影响，探讨DES在乳癌发生中的地位及作用机制。

雌激素受体阳性人乳腺癌MCF-7细胞(武汉中国典型物保藏中心)。

雌二醇(美国Sigma公司)；己烯雌酚(加拿大BBI公司)。WISP-2抗体、BCL-2抗体(美国Santa Cruz公司生产，北京中山公司进口分装)；免疫组化SABC试剂盒(武汉博士德公司)；WISP-2引物、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)引物(上海生工Trizol Gibco公司)；逆转录试剂盒(加拿大BBI公司)；PCR扩增试剂盒(美国Promega公司，北京生物技术有限公司)；四甲基偶氮噻唑蓝(MTT)(美国Amerseco公司，上海化学试剂公司分装)；乙二胺四乙酸(DMEM)；高糖DMEM培养基(美国Gibco公司)。无酚红高糖DMEM培养基(美国Hyclone公司)。

人乳癌(MCF-7)细胞，用含10%小牛血清的DMEM培养基于37℃，5%CO₂，饱和湿度，pH 7.2~7.4条件下常规培养，1~2 d换液1次。培养基中含青霉素100 U/ml，链霉素100 U/ml。试验前换无血清无酚红的乙二胺四乙酸(DMEM)培养基培养72 h，以耗竭内源性雌激素。

用无水乙醇溶解DES后，配制成10 nmol/L应用液，按终浓度为0.1，1，10，100 nmol/L加入培养瓶(板)中。分别作用0，8，24，48，72 h，以雌二醇为阳性对照，分析时间-效应关系。

当培养细胞达到80%融合时用胰酶消化，制成单细胞悬液分别加至96孔培养板，各孔加细胞约12 000个。每板设置4个DES剂量组和1个空白组，每组6个复孔。常规培养24 h后，换无血清无酚红DMEM培养基继续培养72 h，加入不同浓度的DES后，继续培养0，8，24，48，72 h，加入5 mg/ml的MTT 20µl/孔后培养4 h，吸除液体，加二甲基亚砜(DMSO)100 µl/孔，震荡，溶解MTT结晶，于酶标仪上检测吸光度(A₅₇₀)值。

待培养细胞达80%融合时用胰酶消化，调整细胞密度为10⁵/ml，将细胞悬液加至有盖玻片的6孔培养板2 ml/孔，培养24 h，加入相应药物后，按Inadera H方法制片检测蛋白表达^[7]。以细胞内存在棕黄色颗粒为阳性，摄像后用病理图文分析系统计自动计算灰度值。以图片背底灰度值校正后再比较组间差异有无统计学意义。

当常规培养的细胞长至80%融合时用胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞数，等量传代于50 ml的培养瓶。待传后代的细胞长至约80%融合时换无血清无酚红DMEM培养基继续培养72 h，按实验要求加DES、雌二醇。

收集1~2×10⁶，用D-hank's液洗2次，按照Trizol法提取RNA，用琼脂糖电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计检测RNA纯度和浓度，-80℃保存备用。

2.0 µg总RNA 65℃ 3 min预变性，依次加入10×buffle 2.0 µl，25mmol/L MgCl² 4.0 µl，10mmol/L dNTP 2.0µl，0.5mg/ml Oligo(dt)1，5引物1.0µl,RNA inhibitor 0.5 µl，25 u/µl逆转录酶(AMV)0.6 µl，ddH₂O 10.0 µl。总反应体积20 µl;42℃ 90 min;70℃ 10 min，冰上冷却10 min，逆转录产物加入，25nmol/L MgCl² 1.0 µl，10×buffle 2.5 µl，10 nmol/dNTP 0.5 µl，prime(上下游)各1.0 µl，cDNA 1.0 µl，Taq DNA聚合酶0.5 µl，ddH₂O 17.5 µl总反应体系25 µl上PCR仪。循环参数：94℃ 4min;94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸5 min。引物序列：WISP-2(Genebank accession number:XM0095188)。上游5'-CCTACACACACAGCCTATATC-3'；下游5'-CCTTCTCTTCATCCTACCC-3'；GAPDH(Genebank accession number:AF261085)。上游5'-ATGAGAAGTATGACAACAGCC-3'；下游5'-TGAGTCCTTCCACGATACC-3'。PCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳观察结果。电泳条带用凝胶成像系统摄像并作平均密度分析。以各自的基因与内参照基因的平均密度比值比较组间差异有无统计学意义，实验重复3次。

采用SPSS 10.0软件进行方差分析，比较组间差异。

表 1

表 1 DES 对MCF- 7 细胞生长活性的影响( x±s, n= 10)

表 1 DES 对MCF- 7 细胞生长活性的影响( x±s, n= 10)

MTT结果显示，随着DES的作用浓度的增加，MCF-7细胞的生长活性逐渐升高。1.0，10.0，100.0 nmol/L的DES作用MCF-7细胞，A₅₇₀值明显上升，与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10.0与100.0 nmol/L组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。10.0 nmol/L的DES作用细胞0，8，24，48，72 h，随着作用时间的延长，A570值由(0.289±0.086)增加至(0.956±0.127)。8，24，48，72 h组与0 h组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

表 2

表 2 不同浓度DES、E2 作用不同时间对WISP- 2 蛋白表 达影响( x±s, n= 10)

表 2 不同浓度DES、E2 作用不同时间对WISP- 2 蛋白表 达影响( x±s, n= 10)

免疫细胞化学检测显示，DES诱导了WISP-2蛋白的表达，蛋白定位在胞浆。灰度扫描表明，0.1，1.0，10.0 nmol/L的DES作用细胞24 h后，蛋白的表达强度随药物浓度增加而升高，DES1~100 nmol/L组与0.1 nmol/L组比较差异有统计学意义(P<0.05)。10 nmol/LDES作用0，8，24，48，72 h，蛋白表达从8 h开始升高，不同时间组蛋白表达与0 h组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图 1

图 1 10 nmol/ L DES 作用不同时间细胞WISP- 2mRNA 扩增产物

图 2

图 2 不同剂量DES作用细胞24 hWISP- 2mRNA 扩增产物

表 3

表 3 不同浓度DES、E2 作用不同时间WISP- 2mRNA 表达变化( x±s , n= 3)

表 3 不同浓度DES、E2 作用不同时间WISP- 2mRNA 表达变化( x±s , n= 3)

RT-PCR结果显示，DES能诱导MCF-7细胞中WISP-2 mRNA表达增加。0.1，1.0，10.0，100.0 nmol/L的DES作用细胞24 h后，细胞中WISP-2mRNA的表达强度从1.0~100.0 nmol/L逐渐升高，与0.1 nmol/L组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。10 nmol/L DES作用0，8，24，48，72 h后，WISP-2mRNA表达从8 h开始升高，8，24，48，72组的WISP-2mRNA表达与0 h组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。

环境污染是导致人类癌症发病率上升最主要的致病因素，随着美国妇女中乳腺癌的发病率不断上升，环境雌激素污染引起了广泛关注，其中DES与乳腺癌的关系及其机制成为关注的热点。有资料表明，WISP-2基因是雌激素作用的早期效应基因之一^[4]，它直接受雌二醇的调控。据文献报道，WISP-2基因的表达改变与细胞增殖相关，可能是与乳腺癌发展相关的早期基因改变，WISP-2蛋白是一个分泌蛋白^{[6, 7]}。Mclachlan等^[8]实验结果表明，环境雌激素与雌激素受体(ER)结合的形式类似于内源性雌激素，是通过雌激素受体介导相应的生理效应。而WISP-2基因正是雌二醇与雌激素受体结合后早期表达的基因。

本研究结果显示，DES在较宽的浓度范围(1.0~100.0 nmol/L)可使WISP-2mRNA和蛋白表达增加，细胞在10.0nmol/L的DES作用下，随着作用时间的延长表达逐渐增加。本研究还观察到DES使MCR-7细胞摄取MTT的能力呈浓度依赖性和时间依赖性上升，各实验组与对照组比较差异有统计学意义，说明DES可促进MCF-7细胞增殖。

结果表明，乳腺癌发生与WISP-2基因表达相关，可能是DES通过诱导WISP-2基因表达上调，导致癌细胞增殖，在乳癌的进展期，进一步促进癌症的发展。细胞在10.0 nmol/L的DES作用下，于72 h时WISP-2基因表达下降，可能由于时间长，在无血清的环境中细胞增殖降低，细胞凋亡增多，而使WISP-2基因表达降低。