抗菌肽具有热稳定性好、水溶性好、抗菌谱广等优点，是目前国际上的研究热点。抗菌肽不仅抗菌谱广，而且可以抑杀某些真菌、病毒及原虫，并对多种癌细胞及动物实体瘤有明显的杀伤作用，又不破坏正常细胞。抗菌肽可望成为新一代的抗菌、抗病毒、抗癌药物^{[1, 2]}。中国林蛙抗菌肽是从两栖类动物中国林蛙的皮肤中分离纯化得到的。本实验通过体外实验观察中国林蛙抗菌肽对人胃癌细胞生长作用的影响。

中国林蛙(黑龙江大通生物科技有限公司)。葡聚糖凝胶Sephadex G-75、Sephadex G-50、Sephadex G-25（美国Phamacia公司）。SGC-7901细胞来自人胃腺癌细胞系(北京市肿瘤研究所)。细胞在10% RPMI 1640完全培养液中于37℃,5% CO₂孵箱中常规培养。

取林蛙数只，断头，冰浴条件下迅速剥皮，剪碎，弃去血水。以蛙皮重量6倍体积的80%甲醇在4℃浸提24h，过滤，收集滤液，再浸提同样时间，过滤，合并2次所得滤液。将浸提后的蛙皮在80%甲醇中8000r/min匀浆20min，10000r/min离心30min，取上清液。离心后的蛙皮于玻璃匀浆器中再次细匀浆，离心30min（10000r/min），取上清液。合并各步所得提取液，浓缩，冷冻干燥。冻干粉用去离子水溶解，经Sephadex G-75层析分离,1cm×60cm层析柱，0.5%甲醇洗脱，流速为0.2ml/min。每10min收集1管，在波长280nm处测各管紫外吸光度(A)值。以枯草杆菌作为指示菌，收集有抑菌活性的各管并冷冻干燥。将装有Sephadex G-50和Sephadex G-25的两根层析柱（均为1cm×60cm）连接起来，将上面得到的冻干粉用去离子水溶解后上柱。0.5%甲醇洗脱，流速为0.1ml/min,每10min收集1管，在波长280nm处测各管紫外吸光值，收集有抑菌活性的各管，冷冻干燥后得中国林蛙抗菌肽。

将1.0×106个SGC-7901细胞接种于100ml培养瓶，培养24h后，换成含不同浓度中国林蛙抗菌肽的培养液。作用24h后，在倒置显微镜下，观察细胞形态和生长特性的改变，并照相。

常规培养SGC-7901细胞，待细胞生长状态良好后，胰酶消化，接种于96孔培养板中，每孔5×103个细胞。培养24h后，更换含不同浓度中国林蛙抗菌肽的培养液，每个浓度设4个平行孔，另设二甲基亚矾(DMSO)溶剂对照组。培养1，2，3，4，5，6，7d后分别加入新鲜配制的MTT磷酸盐缓冲液[(PBS)配成5g/L浓度)]20µl/孔，再培养4h后倒尽板中的培养液，各孔加DMSO 150µl，振荡10min，用酶标仪在波长570nm处测定各孔的吸光度（A）值。以每组4个孔A的平均值作为各组的平均A值。根据下列公式计算细胞的生长抑制率（inhibitory frequency，IF)：IF（%）=（1-给药组A/对照组A）×100%。

将人胃癌细胞SGC-7901接种于24孔培养板内，每孔2×104个细胞，每个剂量4个平行孔。培养24h后，更换含不同浓度中国林蛙抗菌肽的培养液，分别培养24，48h后，甲醇固定，Giemsa染色。计数2000个细胞中所含分裂相的细胞数，求出分裂指数，并与对照组比较，计算抑制率(IF)。

将人胃癌细胞SGC-7901细胞接种于24孔培养板内，每孔400个细胞，每组设4个平行孔。培养24h后更换含不同浓度中国林蛙抗菌肽的培养液，再分别培养24，48h后，换正常培养液继续培养7d，甲醇固定，Giemsa染色。镜下计数每孔>50个细胞的集落数目，计算集落形成率、集落形成抑制率。集落形成率（%）＝每皿集落数/每皿接种细胞数×100；集落形成抑制率（%）＝（1-给药组集落数/对照组集落数）×100

采用SPSS12.0软件进行统计分析。

图 1

图 1 图1 阴性对照组( ×400)

图 2

图 2 图2 25μg/ ml 抗菌肽作用24h( ×400)

在倒置显微镜下，SGC-7901细胞在阴性对照组中，可见细胞聚集性生长，生长状态良好，细胞数量多、轮廓清楚、附壁紧密。中国林蛙抗菌肽剂量组中，抗菌肽剂量为25µg/ml作用于SGC-7901细胞24h时，可见细胞数量减少，体积减小及细胞膜出现孔洞，细胞附壁疏松，分泌物和浮起的死细胞增加。随抗菌肽剂量的增加，上述表现越明显。

中国林蛙抗菌肽对SGC-7901细胞生长有抑制作用。随着药物浓度增加，作用时间延长，细胞增殖速度减慢，呈剂量-效应关系和时间-效应关系。抗菌肽各剂量组的7d抑制率分别为14.9%，49.2%，73.0%，93.6%。

表 1

表 1 抗菌肽对SGC27901 细胞有丝分裂的抑制结果

表 1 抗菌肽对SGC27901 细胞有丝分裂的抑制结果

中国林蛙抗菌肽作用SGC-7901细胞24和48h对细胞有丝分裂均有明显的抑制作用。并随着时间的延长，抑制作用增强。当剂量为100µg/ml时，作用24h的抑制率为85%；作用48h为88.7%。

表 2

表 2 抗菌肽对SGC27901 细胞集落形成的抑制结果

表 2 抗菌肽对SGC27901 细胞集落形成的抑制结果

中国林蛙抗菌肽各剂量组与对照组比较，对SGC-7901细胞集落形成均有显著抑制作用（P<0.01）。且随剂量增加，抑制作用增加。当剂量为100µg/ml时，作用24h，集落形成抑制率为82.3%；作用48h，集落形成抑制率为87.8%。

抗菌肽分子可以相互聚集在细菌细胞膜上形成离子通道,导致细胞内容物外流而死亡^{[3, 4]}。对抗菌肽抗癌作用研究的结果表明,抗菌肽杀死癌细胞机制比杀菌机制更为复杂，抗菌肽对癌细胞核染色质DNA也可能产生作用^[5]。

本研究结果表明，当中国林蛙抗菌肽的剂量低于50µg/ml时，细胞随作用时间的延长继续生长，并随剂量的增加，生长趋于缓慢。中国林蛙抗菌肽对SGC-7901细胞的作用可能存在一个阀值，当抗菌肽的浓度低于50µg/ml时，抗菌肽对肿瘤细胞膜的攻击作用不显著，抗菌肽对肿瘤细胞核染色质DNA也可能产生作用。当中国林蛙抗菌肽的剂量达到50µg/ml，作用48h，对SGC-7901细胞生长抑制作用就已达到60%以上，随着作用时间的延长，细胞生长缓慢。当剂量达到100µg/ml时，细胞基本停止生长，这可能是由于抗菌肽在肿瘤细胞膜上形成离子通道，对细胞产生直接的杀伤作用造成的。