胰腺癌是人体常见的恶性肿瘤之一，近年来在全球范围内呈明显上升态势，其恶性程度高、转移早、早期诊断困难，预后极差，90％以上病例死于发病后1年，5年存活率仅为0.4％～3％^[1]。早期转移是影响胰腺癌预后的主要因素之一。文献报道，新生血管的生成是肿瘤生长、侵袭及转移的重要因素，而环氧合酶-2(COX-2)是新近被证实具有促进肿瘤生长的调节物质^[2]。因此，选择性阻断COX-2的活性，可能有利于胰腺癌的预防和治疗。本实验旨在通过观察COX-2选择性抑制剂瑞芝清对人胰腺癌PANC-1细胞COX-2和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响，探讨瑞芝清抑制肿瘤血管生成的机制，为开辟新的抗癌途径提供基础依据。

人胰腺癌细胞株PANC-1(中科院上海细胞所)，常规培养于Dulbecco's Modifided Eagle's Medium(DMEM)培养基(含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素)中，在37℃、5％C0₂培养箱中贴壁培养，取对数生长期的PANC-1细胞用于实验。瑞芝清(美国Sigma公司)；TRIzol、DMEM、二甲基亚砜(DMSO)(美国Invitrogen公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)，COX-2和VEGF小鼠单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；其他试剂均为市售分析纯。瑞芝清用DMSO溶解后配成400mmol/L的储备液，实验时用DMEM培养液稀释到所需浓度。

将对数生长期的PANC-1细胞按每孔5×10⁵个细胞接种于6孔板中，每培养孔放置直径12mm经多聚赖氨酸处理的无菌盖玻片，置37℃、5%CO₂及饱和湿度条件下，待24h贴壁生长后换液，分别加入不同浓度瑞芝清，使其终浓度分别为50,100,200,400µmol/L。设未进行药物干预的细胞为对照组，每组平行5个样本。继续培养48h取出玻片，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗，4％甲醛固定5min，放置于37℃恒温箱2h后取出，进行免疫组化染色。采用Power Vision^TM两步法，操作步骤按试剂说明书进行。COX-2、VEGF皆为胞质着色，胞浆出现棕色或棕褐色颗粒为阳性细胞，高倍镜观察10个视野，计算阳性细胞占所有细胞的比率。

收取不同药物浓度处理48h后细胞，应用TRIzo1常规提取细胞总RNA，经紫外微量分光光度仪定量后，取3µg总RNA，随机引物法逆转录合成cDNA。以磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为内对照，进行半定量聚合酶链反应(PCR)。COX-2上游引物：5'-TGAAACCCACTCCAAACACAG-3'，下游引物：5'-TCATCAGGCACAGGAGGAAG-3'；目的片段大小为232bp。GAPDH上游引物：5'-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3',下游引物：5'-AGGCCATGCCAGTGAGCTTC-3'；目的片段大小为431bp。PCR反应条件为：94℃4min预变性后，94℃1min，56℃1min，72℃1min，共32个循环，72℃延伸10min，4℃保存。6µ1 PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，采用Kodak DNA analysis 2.0凝胶成像系统吸光度扫描分析。

收取不同药物浓度处理48h后细胞，应用TRIzol常规提取细胞总RNA，经紫外微量分光光度仪定量后，取3µg总RNA，随机引物法逆转录合成cDNA。以β-actin作为内对照，进行RT-PCR。VEGF引物序列上游：5'-AGGAGGGCAGAATCATCACG-3'，下游：5'-TATGTGCTGGCCTFGGTGAG-3'，目的片段大小为405bp。β-actin：上游5'-TCGTACCACTGGCATTGTGA-3'，下游5'-TCCTGCTTGCTGATCCACAT-3'，目的扩增产物预期长度为765bp。PCR反应条件为：94℃4min预变性后，94℃1min，55℃1min，72℃1min，共30个循环，72℃延伸10min，4℃保存。6µl PCR扩增产物在1.5％琼脂糖凝胶中电泳，采用Kodak DNA analysis 2.0凝胶成像系统吸光度扫描分析。

采用SPSS 11.0软件进行方差分析及q检验，不同参数之间进行Pearson相关分析。

免疫组化结果显示，不同浓度瑞芝清处PANC-1细胞48h后，随着药物浓度的增大，COX-2和VEGF蛋白表达水平逐渐降低，且具有剂量依赖性，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；并且COX-2与VEGF之间具有良好的相关性(r=0.785，P<0.05)。

表 1

表 1 不同浓度瑞芝清对COX- 2 和VEGF 蛋白表达的影响( x±s, %)

表 1 不同浓度瑞芝清对COX- 2 和VEGF 蛋白表达的影响( x±s, %)

RT-PCR结果显示，不同浓度瑞芝清处理PANC-1细胞48h后,随着药物浓度的增加，COX-2 mRNA和VEGFmRNA表达水平逐渐下降，且呈现剂量依赖性(图 1，图 2)。

图 1

M: Maker;1: 400µLmol/ L; 2: 200µLmol/ L; 3: 100µLmol/ L; 4: 50µLmol/ L; 5: 对照组 图 1 不同浓度瑞芝清对PANC- 1 细胞COX- 2 mRNA 表达影响

图 2

M: Maker; 1: 对照组; 2: 50µLmol/ L; 3: 100µLmol/ L; 4: 200µLmol/ L; 5: 400µLmol/L 。 图 2 不同浓度瑞芝清对PANC- 1 细胞VEGF mRNA 表达影响

环氧合酶(Cyclooxygenase，COX)存在COX-1和COX-2两种异构体，COX-1呈构成性表达，是维持机体正常生理功能的看家基因，在胃肠道的保护、维持正常的肾功能及凝血功能等方面起重要作用；COX-2是前列腺素(prostaglandin，P G)生物合成过程中的一个重要限速酶，可被缺氧、炎症、细胞因子、生长因子、有丝分裂原及肿瘤促进因子等多种因素诱导产生，是非甾体类抗炎药(NSAIDs)作用的靶基因^[3]。COX-2不仅是抗炎作用的中心环节，而且在多种肿瘤组织中表达上调，在肿瘤的发生和发展中起着重要作用^[4]。肿瘤的浸润转移与COX-2、VEGF的高表达有关^[5]。VEGF是一高特异性血管内皮细胞有丝分裂原，是肿瘤新生血管生成的重要调控因子，不仅参与肿瘤血管生成、增殖，还直接与肿瘤浸润、转移有关。有关研究亦证实，VEGF是迄今所发现最强、最特异的促血管生成因子之一，在肿瘤新生血管形成过程中起关键作用^[6]。COX-2是新近被证实具有促进肿瘤生长的调节物质，且其表达的程度与肿瘤的病程密切相关。Tsujii等^[7]体外实验发现，COX-2可能通过调节血管生成因子而促进结肠癌新生血管生成。Liu等^[8]体内研究揭示，选择性COX-2抑制剂NS-398能显著抑制前列腺癌新生血管的生成。

文献报道^[9]，血管生成剂TNP-470单独或联合应用抗代谢剂顺铂可显著抑制小鼠胰腺癌肝脏转移，提示抑制血管生成对胰腺癌生长与转移可能具有一定的干预作用。本研究发现，不同浓度瑞芝清作用于胰腺癌PANC-1细胞48h后,COX-2和VEGF蛋白表达率与对照组比较明显降低(P<0.05)，并且COX-2与VEGF之间具有良好的相关性(r=0.785，P<0.05)。RT-PCR结果也显示，随着药物浓度的增大，COX-2mRNA和VEGFmRNA表达逐渐减弱。由此可见，在胰腺癌中COX-2促进新生血管生成的机制可能与其上调VEGF等因子有关。提示抑制COX-2的表达及由此引起的VEGF表达降低，在非甾体类抗炎药抑制肿瘤血管生成机制中可能具有一定作用。