二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)复合物是山东大学毒理学研究所研制的一种以DHA为主要成分的复方抗癌新药，体内及体外对多种癌细胞具有明显的杀伤作用，抗癌机制尚不清楚^[1-4]。酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase TPK)在细胞生长、增殖、分化、转化等过程中起着重要的调节作用，并与肿瘤的发生密切相关。我们用［γ^-32P］三磷酸腺苷(adenosine triphosphate;ATP)作为反应启动剂掺入外源性底物的方法测定TPK活性，研究DHA复合物对H₂₂癌细胞内TPK活性的影响，从而探索其抗癌机制。

清洁级小鼠50只，昆明种，18～22g，雄雄各半(山东大学实验动物中心)。

小鼠H₂₂肝癌细胞株(山东省医学科学院药物所)。

DHA复合物由本室自行研制，用0.5%羟甲基纤维素钠配制，现用现配。多聚氨基酸(谷氨酸∶丙氨酸∶酪氨酸＝4∶1∶1)，Polu(Glu∶Ala∶Tyr=4∶1∶1)(美国Sigma公司)；［γ^-32P］ATP(北京福瑞生物制品公司)。其他试剂为国产或进口分析纯。

取H₂₂癌细胞种鼠，腹部消毒后，抽取腹水，分离H₂₂癌细胞，制成浓度为1.0×10⁷/ml的细胞悬液，台盼蓝染色检查细胞活性，成活率95%以上即可接种。于每只小鼠左腋窝下接种0.2ml，整个操作过程30min内完成。24h后，将小鼠随机分成4组，每组10只，溶剂对照组灌服羟甲基纤维素钠125mg/kg，DHA复合物高、中、低剂量组分别灌服DHA复合物55.0，37.5，20.0mg/kg，每日1次，连续10d，停药24h，处死小鼠，解剖剥离瘤组织称重。另设正常对照组，10只小鼠。按以下公式计算抑瘤率。

抑瘤率(%)＝$\frac{溶剂对照组瘤重(g)-实验组瘤重(g)}{溶剂对照组瘤重(g)}$×100％。

按参考文献^[5,6]制备样品。

Lowry法测定蛋白含量^[7]。

按改良的Kong和Wang氏法^[8]。每50µl酶反应液［20mmol/L Tris^-HCl pH7.5,50mmol/L MgCl₂,10mmol/L,MnCl₂,2.5mmol/L Na₃VO\-4,7mg/ml对硝基苯磷酸(PNPP)，2mmol/L三氟吡啦嗪(TFP)，4mg/ml ［Poly(glu∶Ala∶Tyr=4∶1∶1］300µmol/L ［γ^-32P］ATP(含0.5µCi)］中加入3µg酶蛋白，加［γ^-32P］ATP启动反应，30℃，准确反应5min，加10%预冷的三氯乙酸3ml终止反应，然后抽滤至玻璃纤维素膜上，分别以预冷5%三氯乙酸，预冷的无水乙醇各洗涤一次，待干燥后将玻璃纤维素膜放入闪烁瓶里，加入5ml闪烁液，2h后，以Bckmannals3801液闪记数仪测定其放射性强度。

用Stata软件进行统计学处理，多个实验组与对照组的比较用最小显著差(LDS)法(单侧检验)。

溶剂对照组肿瘤平均重量1.0g，DHA复合物实验组平均瘤重均小于溶剂对照组，差异有统计学意义(55.0，37.5，20.0mg/kg组t值分别为8.939，8.010，4.411，P值均为0.000)，且抑瘤率均>30%，表明DHA复合物在体内有明显的抑瘤作用。表 1 DHA复合物对H₂₂癌细胞的抑制作用

表 1

表 1 DHA复合物对H22癌细胞的抑制作用

表 1 DHA复合物对H22癌细胞的抑制作用

表 2

表 2 DHA复合物对H22癌细胞各亚细胞成分TPK活性的影响( x ±s)

表 2 DHA复合物对H22癌细胞各亚细胞成分TPK活性的影响( x ±s)

癌细胞细胞核、细胞质、细胞膜、内质肉和线粒体中TPK的活性与正常对照组比较，差异有统计学意义（t分别为10.651，21.162，25.412，28.573，24.849，P值均为0.000)。给予DHA复合物作用后，癌细胞上述各组分中TPK的活性与溶剂对照组比较，差异有统计学意义(细胞核55.0，37.5，20.0mg/kg组t分别为6.532.912，0.130，P分别为0.000，0.002，0.448；细胞质5560，37.5，20.0mg/kg组t值分别为16.451，11.011，4.825，P值为0.000；细胞膜55.0，37.5，20.0mg/kg组t值分别为18.569，10.312，7.543，P值均为0.000；内质网55.0，37.5，20.0mg/kg组t值分别为20.415，14.794，6.169，P值均为0.000)，表明H₂₂癌细胞上述各组分中TPK的活性普遍升高，而DHA复合物可显著降低癌细胞TPK活性。

酪氨酸蛋白激酶(TPK)是催化蛋白质酪氨酸残基磷酸化反应的酶，活化后的TPK可诱导产生多种细胞内效应，包括离子流、产生第二信使及多蛋白的磷酸化。TPK的过度活化将导致整个细胞信号传导处于高活性状态，引起细胞骨架受损，细胞形态与功能异常，细胞持续增殖、恶变，导致肿瘤发生。

本实验结果显示，H₂₂癌细胞中，细胞核、细胞质、细胞膜、内质网及线粒体中的TPK活性均明显升高，且差异有统计学意，提示TPK活性异常可能是H₂₂癌细胞无限增殖的一个重要原因。经DHA复合物作用后，H₂₂癌细胞各亚细胞成分中的TPK活性均显著降低，且随DHA复合物剂量的增加，TPK活性降低越明显，呈明显的剂量-反应关系，其中高剂量组各亚细胞成分中TPK活性已降低至接近正常水平。表明DHA复合物可通过抑制TPK的活性，降低细胞内的信号传递，使细胞生长增殖受到抑制，从而达到抑制肿瘤的目的。