中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (8): 900-901   PDF    
引用本文
彭俊华, 糜漫天, 朱俊东. 环境雌激素对大鼠乳腺癌VEGF和CXCR4影响[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(8): 900-901.
PENG Jun-hua, MI Man-tian, ZHU Jun-dong Effects of environmental estrogen chemicals on VEGF and CXCR4 expressions in breast cancer of rats[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(8): 900-901.
环境雌激素对大鼠乳腺癌VEGF和CXCR4影响
彭俊华, 糜漫天, 朱俊东     
第三军医大学营养与食品卫生教研室,重庆400038
收稿日期: 2006-11-24
基金项目: 国家自然科学基金(30000136)
作者简介: 彭俊华(1966- ),男,湖南祁东县人,副主任医师,博士,主要从事环境毒理和营养与肿瘤的研究.。
通讯作者: 糜漫天
摘要： 目的 研究环境雌激素辛基酚(OP)和三羟异黄酮(GEN)对大鼠乳腺癌中血管内皮生长因子(VEGF)及其受体(flk-1)和血小板源性因子受体-4(CXCR4)表达的影响. 方法 雌性SD大鼠随机分为对照组(Con)、模型组(Mod)及3个实验组:GEN、OP和GP(GEN+OP).二甲基苯蒽启动致乳腺癌(Con组除外),第210d处死大鼠,用免疫组化和免疫印迹检测大鼠乳腺及乳腺癌组织中VEGF、flk-1和CXCR4表达. 结果 与Mod组比较,GEN组VEGF、flk-1和CXCR4蛋白表达均降低,OP组VEGF、flk-1和CXCR4表达增高,GP组CXCR4降低. 结论 GEN通过下调乳腺癌组织中VEGF、flk-1和CXCR4的表达量,降低大鼠乳腺癌的发生,OP则通过上调VEGF、flk-1和CXCR4的表达使乳腺癌的发生率增加.
关键词： 乳腺癌     环境雌激素     血小板源性因子受体-4     血管内皮生长因子    
Effects of environmental estrogen chemicals on VEGF and CXCR4 expressions in breast cancer of rats
PENG Jun-hua, MI Man-tian, ZHU Jun-dong     
Department of Nutrition and Food Hygiene,College of Military Preventive Medicine,the Third Military Medical University Chongqing 400038,China
Abstract: Objective To study the effects of enviromental estrogen chemicals octylphenol(OP)and genistein(GEN)on the expressions of vascular endothelial growth factor(V EGF),V EGF receptor(flk-l)and CXC chemokine receptor type 4(CXCR4)in rat breast cancer. Methods Female Sprague-Dawley rats were randomly divided into control,model,GEN treated,OP treated and GP(GEN+OP)treated group.After 7,12-dinmethylbenz[a]anthracene(DMBA)induced rat breast cancers(Except rats in control group),rats were killed on day 210.Western blotting and immunohistochemistry methods were used to detect the expressions of V EGF,CXCR4 and flk-1 on normal mammary grand and mammary cancers. Results Compared with model group,V EGF,CXCR4 and ilk-1 expressions were significantly decreased in mammary cancers of genistein treated group,while they were significantly increased in octylphenol treated group.CXCR4 expression was significantly decreased in GP treated group. Conclusion GEN is down-regulate V EGF,CXCR4 and flk-1 expressions in mammary cancer then may inhibits the incidences of DMBA-induced mammary cancers.OP is up-regulate V EGF,CXCR4 and flk-1 expressions in mammary cancer then may increase the incidences of DMBA-induced mammary cancers.
Key words: breast cancer     environmental estrogen chemicals     CXCR4     V EGF    

肿瘤的发生是多因素、多基因、多阶段作用的结果,血管内皮生长因子(VEGF) 及其受体VEGFR-2 (flk-1) 在促进新生血管形成、血管发生及再生、提高血管通透性等方面发挥重要作用。基质细胞衍生因子- 1 (SDF-1) 与血小板源性因子受体-4 (CXCR4) 构成SDF-1/ CXCR4 轴,在介导炎症反应、造血干细胞迁移及归巢、恶性肿瘤的浸润转移等方面发挥着重要的作用。研究表明,三羟异黄酮(genistein ,GEN) 能降低大鼠乳腺癌的发生,减少每鼠肿瘤个数,辛基酚(octyiphe2no I ,OP) 则表现相反的效应[1],GEN 还抑制肿瘤的血管生成。本研究采用二甲基苯蒽(7 ,12-dinmethylbenz〔a〕anthracene ,DMBA) 诱导大鼠产生乳腺癌,观察环境雌激素影响VEGF、flk-1 和CXCR4 在乳腺癌发生中的变化,探讨环境雌激素影响肿瘤发生的机制。

1 材料与方法 1.1 试剂

二甲基苯蒽(DMBA) ,辛基酚(octylphenol ,OP)(美国Sigma 公司) 。三羟异黄酮(genistein ,GEN) (西安交大保赛生物技术公司) 。兔抗VEGF、CXCR4 抗体和小鼠抗flk- 1 抗体,按1∶40 ,1∶40 和1∶75 倍稀释,链酶亲和素- 生物素- 过氧化物酶复合物( SABC) 试剂盒及二氨基联苯胺(DAB) 显色试剂盒(美国博士德公司) 。异硫氰酸荧光素(FITC) 标记羊抗小鼠抗体(北京中杉公司) 。二甲基亚砜(进口分装试剂) 。

1.2 乳腺肿瘤模型与分组

按文献[1]建立乳腺癌模型和分组,SPF 级雌性(SD) 大鼠,随机分为4 组:模型组(Mod) ,GEN组,OP 组,GP 组( GEN + OP) ,每组21 只大鼠。大鼠乳腺肿瘤经病理证实为乳腺癌后进行VEGF、flk-1 和CXCR4 蛋白表达的研究。

1.3 免疫组化检测蛋白表达

乳腺癌组织经常规固定、脱水、包埋、切片、封闭,加一抗于37 ℃孵育50min ,VEGF、CX2CR4 按SABC 试剂盒操作,DAB 显色,脱水、透明,显微镜观察并照相,图像分析软件处理结果。flk-1 滴加荧光素标记二抗孵育20min ,甘油封片,德国的Leica-NT 激光共聚焦显微镜观察、照相及数据分析。用Image-proplus 图像分析软件进行半定量分析,以吸光度表示,每组实验取3 只大鼠,每只大鼠取2 张片子,每张片子取3～6 个视野,每个视野吸光度为不同吸光度×面积总和,计算各组的平均吸光度,或计算荧光强度。

1.4 免疫印迹分析蛋白表达

正常乳腺组织及乳腺癌组织经蛋白质提取、浓度测定、十二烷基硫酸钠- 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 、电转移、免疫印迹、照相。

1.5 统计分析

采用SPSS 1010 软件进行单因素方差分析。

2 结果 2.1 免疫组化分析蛋白表达

免疫组化原位分析发现,VEGF、flk-1 和CXCR4 主要表达在胞浆中。结果显示,与 Mod 组比较,GEN 组VEGF、flk-1 和CXCR4 表达均明显降低,OP 组VEGF、flk-1 和CXCR4 表达明显增高,GP 组的CXCR4 也明显降低(图 1) 。

VEGF(ABC 法, ×200) CXCR4 (SABC , ×400) flk - 1 (Sp - FITC , ×200) 图 1 免疫组化分析环境雌激素对乳腺癌中蛋白表达的影响

2.2 免疫印迹分析蛋白表达

免疫印迹分析检测结果显示,聚偏二氟乙烯( PVDF) 膜上棕色染条带深浅变化明显,条带越深,提示蛋白表达量越高,结果与免疫组化一致(图 2) 。

图 2 免疫印迹分析环境雌激素对乳腺癌中蛋白表达的影响

3 讨论

研究发现,第180 d 时OP 组血中孕酮含量降低,乳腺癌组织中VEGF 表达可能也增加,表现为乳腺癌的发病率增加也较明显[2]。在DMBA 诱导大鼠侵袭性乳腺癌中,VEGF 和flk-1表达增高,表明VEGF 依赖性的血管生成参与了乳腺癌从侵袭性病变发展到可触摸性病变[3]。雌激素能直接刺激靶组织和肿瘤中VEGF 的转录,VEGF 抗体能抑制裸鼠体内肿瘤的生长[4],flk-1 表型缺陷小鼠,血管生成减少,小鼠815～915 d 胎死腹中[6]。本研究发现,GEN 可抑制乳腺癌组织中VEGF 和flk-1 的表达,抑制肿瘤血管生成和肿瘤的侵袭能力,减少肿瘤的发生,OP 组VEGF 表达增高,促进肿瘤血管生成和侵袭,增加肿瘤发生。本研究发现,GEN、GP 能下调乳腺癌组织中CXCR4 的表达,抑制肿瘤的生长转移和新生血管形成,抑制肿瘤发生。OP 则上调癌组织中CXCR4 的表达,表现出与GEN相反的效应。C-erbB2 通过激活CXCR4 转录,提高组织中CXCR4 的表达[5]。我们以前的研究发现,GEN 能下调组织中C-erhR2 的表达,降低肿瘤发生。总之,青春期给予GEN 能降低二甲苯蒽诱导大鼠乳腺癌的发病,减少肿瘤重量,可能与GEN 能抑制乳腺癌组织中VEGF、flk-1 和CXCR4 的表达,降低肿瘤血管生成和肿瘤侵袭有关。

参考文献
[1] 王斌, 糜漫天, 彭俊华, 等. 辛基酚和三羟异黄酮对大鼠乳腺癌发 生及细胞增殖影响的研究[J]. 第三军医大学学报, 2005, 27(2) : 119–122.
[2] Heffelfinger SC, Yan M, Gear RB, et al. Inhibition of VEGFR2 pre2 vents DMBA - induced mammary tumor formation[J]. Lab Invest, 2004, 84(8) : 989–998. DOI:10.1038/labinvest.3700128
[3] Kim LS, Huang S, Lu W, et al. Vascular endothelial growth factor expression promotes the growth of breast cancer brain metastases in nude mice[J]. Clin Exp Metastasis, 2004, 21(2) : 107–118. DOI:10.1023/B:CLIN.0000024761.00373.55
[4] Sakurai Y, Ohgimoto K, Kataoka Y, et al. Essential role of Flk - 1 (VEGF receptor 2) tyrosine residue 1173 in vasculogenesis in mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2005, 102(4) : 1076–1081. DOI:10.1073/pnas.0404984102
[5] Li YM, Pan Y, Wei Y, et al. Upregulation of CXCR4 is essential for HER2 - mediated tumor metastasis[J]. Cancer Cell, 2004, 6(5) : 459–469. DOI:10.1016/j.ccr.2004.09.027