2007, Vol. 23
2. 山东大学山东省立医院;
3. 美国辛辛那提大学辛辛那提儿童医院糖尿病中心
人类的1型糖尿病和非肥胖糖尿病（Non-obese diabetic，NOD）鼠均是T细胞介导的自身免疫性疾病[1, 2], 其发生是因为炎性细胞浸润胰岛引起胰岛炎，造成产生胰岛素的胰岛β细胞的进行性破坏和数量减少，胰岛素产生不足。浸润胰岛的炎性细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、B细胞、树突状细胞、巨噬细胞等。已有研究证实，1型糖尿病的发生既需要CD4+T细胞也需要CD8+T细胞[3-5], 但二者各自所起的作用尚不清楚。探讨胰岛炎性细胞浸润的启动是目前1型糖尿病研究的热点。本研究利用NOD背景的转基因小鼠，通过过继转移试验来观察CD8+T细胞在糖尿病发病中的作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 小鼠NOD/LTJ小鼠、BDC2.5 NOD.scid小鼠和NOD.scid小鼠[6, 7]和T细胞缺陷的NOD (NOD.scid) 小鼠[8](美国Jackson实验室)。NOD.scid.Rip.B7[8, 9], NOD.Ragnull.AI4α和NOD.Ragnull.AI4βTCR转基因鼠[10](美国Jackson实验室)。表达对β细胞抗原特异性的、H2Kd限制性TCR的NOD.Ragnull.AI4αβ转基因鼠由NOD.Ragnull.AI4α和NOD.Ragnull.AI4βTCR转基因鼠杂交而来。
1.1.2 试剂PE标记的CD4+特异性的单克隆抗体和FITC标记的Vβ4特异性的单克隆抗体 (美国Caltag公司)，FITC标记的AI4 CD8+T细胞特异性抗体和PE标记的TCR Vα8.3特异性抗体 (美国BD Pharmingen公司)。
1.2 方法 1.2.1 脾细胞的分离[10, 11]将新鲜脾用2块灭菌载玻片的毛边将脾研磨碎, 4℃，400 g离心5 min, 弃上清；加红细胞裂解液2.5 ml/脾，混匀后立即4℃，400 g离心5 min，弃上清; 洗去红细胞裂解液，4℃，400 g离心5 min，去上清；用磷酸盐缓冲液 (PBS) 将白细胞充分悬浮，计数白细胞。
1.2.2 筛选小鼠基因型B7基因用聚合酶联反应的方法（PCR）确定阳性, scid和β2mnull用流式细胞分析的方法确定。
1.2.3 过继转移试验参照文献[7]进行。
1.2.4 流式细胞分析用Becton Dickinson FACScalibur流式细胞仪检测，运行CELLQuest软件（Becton Dickinson, San Jose, CA）采集数据，WinMDI 2.8软件进行分析。
1.2.5 糖尿病和胰岛炎的评估当连续2 d测定血糖均>16.7 mmol/L时评定为糖尿病，切除胰腺，用10%福尔马林液固定, 石蜡包埋，每间隔100 μm连续非重叠性切片并HE染色，评定胰岛炎。胰岛评分[12]：正常胰岛（无淋巴细胞侵润），胰岛外周炎（淋巴细胞浸润在胰岛周围），胰岛炎（淋巴细胞浸润至胰岛内）。
1.3 统计分析应用SPSS 11.0软件进行分析，用T Test方法进行统计分析，检验水平α=0.01。
2 结果 2.1 幼年NOD鼠体内致糖尿病性T细胞 (图 1)转移2周龄NOD鼠的脾细胞后11周100%的NOD.scid.Rip.B7鼠发生糖尿病，而在对照组 (NOD.scid组），即使转移脾细胞后20周仍然没有受体鼠发生糖尿病。在转移脾细胞后9周，当大部分NOD.scid.Rip.B7受体鼠发生糖尿病时，在NOD.scid受体鼠组尚没有检测到胰岛淋巴细胞浸润。并且，转移3周龄NOD鼠的脾细胞后2组均有糖尿病发生，但NOD.scid对照组的发病率（转移后9周时发病率13%）远低于NOD.scid.Rip.B7试验组的发病率（转移后9周时发病率100%）（P < 0.001）。
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图 1 2周龄NOD鼠脾细胞诱导的糖尿病 |
2.2 β细胞上CD80的表达不影响CD4+T细胞的致糖尿病能力
静息的BDC2.5CD4+T细胞腹腔注射给6~8周龄NOD.scid.Rip.B7实验组和6~8周龄NOD.scid对照组后观察到的糖尿病发生率和特点相同，并且不同数量的BDC2.5 CD4+T细胞转移到NOD.scid.Rip.B7和NOD.scid受体鼠所诱导的糖尿病发生率及发病特点都相似。
2.3 β细胞上CD80的表达影响CD8+T细胞的致糖尿病能力将4周龄NOD.Ragnull.AI4 TCR转基因鼠的脾细胞腹腔注射至6~8周龄的NOD.scid.Rip.B7和年龄匹配的NOD.scid鼠，2组鼠均发生糖尿病，但发病特点却显著不同。所有NOD.scid.Rip.B7组在接受CD8+T细胞转移后24 d（图 2）和45 d（图 3）均发生显性糖尿病，但与所转移的T细胞数量有关。在NOD.scid对照组，只是在转移CD8+T细胞后100 d才有80%~100%的延迟发生症状明显的糖尿病。9~10 d NOD.Ragnull.AI4 TCR转基因鼠的脾细胞转移到NOD.scid.Rip.B7鼠，31 d后开始有受体鼠发生糖尿病，在转移脾细胞后55 d所有受体鼠均发生糖尿病，但这种静息的AI4 CD8+T细胞却不能将糖尿病转移到NOD.scid受体鼠（图 4）。静息AI4 CD8+T细胞转移到NOD.scid鼠60 d后尚未发现有受体鼠发生胰岛炎，但在120 d时NOD.scid组的部分受试对象发生外周胰岛炎和胰岛炎（图 5）。
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图 2 转移7×105 CD8+T细胞 |
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图 3 转移7×104 CD8+T细胞 |
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图 4 静息的CD8+T细胞不能将糖尿病过继转移给NOD.scid鼠 |
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图 5 120 d时NOD.scid组外周胰岛炎和胰岛炎 (HE，×200) |
3 讨论
本研究以NOD鼠作动物模型，利用基因工程构建NOD背景的转基因鼠来研究CD8+T细胞在1型糖尿病发病中的作用。首先检验了幼年NOD鼠体内是否存在胰岛β细胞特异性的致糖尿病性T细胞。将14 d龄NOD鼠的脾细胞转移给6~8周龄NOD.scid.Rip.B7鼠和年龄与之匹配的NOD.scid鼠[7]。转移脾细胞后11周100%的NOD.scid.Rip.B7鼠发生糖尿病，而在NOD.scid对照组，即使转移脾细胞后20周仍然没有受体鼠发生糖尿病。另外，在转移脾细胞后9周，当大部分NOD.scid.Rip.B7受体鼠发生糖尿病时，在NOD.scid受体鼠组尚没有检测到胰岛淋巴细胞浸润。2周龄NOD小鼠的脾细胞可将糖尿病转移到NOD.scid.Rip.B7小鼠中，说明14 d龄的NOD鼠的脾细胞含有β细胞特异性T细胞。在NOD.scid受体鼠中无胰岛炎和糖尿病，也表明在幼年NOD鼠中的T细胞库和/或致糖尿病的T细胞的数量有限。转移3周龄NOD鼠的脾细胞后，2组受体鼠均有糖尿病发生，但对照组NOD.scid组的发病率（转移后9周时发病率13%）远低于NOD.scid.Rip.B7试验组的发病率（转移后9周时发病率100%）（P < 0.001）, 表明T细胞的致糖尿病能力随着NOD供体鼠年龄的增长而增加 (如图 3)。实验组与对照组糖尿病发生率的明显差异表明，CD80在β细胞上的表达促进了静息T细胞对糖尿病的转移诱导，提供了T细胞与胰岛β细胞直接作用的证据。但静息CD8+T细胞不能将糖尿病转移到NOD.scid受鼠。静息AI4 CD8+T细胞注射到NOD.scid鼠60 d后尚未发现有受体鼠发生胰岛炎，但在120 d时NOD.scid组的部分受试对象发生外周胰岛炎和胰岛炎。在β细胞上表达共刺激分子CD80的NOD.scid.Rip.B7受体鼠糖尿病的快速发生证明了CD8+T细胞和β细胞之间的直接作用，NOD.scid受体鼠胰岛炎的低发生率提示CD80在胰岛淋巴细胞浸润过程中对静息CD8+T细胞发挥了协同刺激作用。
由于人类和NOD鼠在组织相容性复合物（MHC）Ⅱ类等位基因和1型糖尿病易感性之间的强大的基因连锁性，过去的多数研究集中于CD4+T细胞在糖尿病发病中的作用，并且认为CD4+T细胞启动胰岛炎，而CD8+T细胞只起辅助作用，负责β细胞的最后破坏[13, 14]。本研究发现，当2周龄NOD鼠的脾细胞转移到有T细胞缺陷的NOD鼠（即NOD.scid鼠）时，不引起受鼠胰岛炎和糖尿病，而当2周龄NOD鼠的脾细胞转移到有共刺激分子CD80的T细胞缺陷的NOD鼠（即NOD.scid.Rip.B7鼠）时，不但引起受鼠胰岛炎而且促进其糖尿病的加速发展，表明CD8+T亚群启动了胰岛的淋巴细胞浸润，而且CD8+T细胞是通过与胰岛β细胞直接作用启动糖尿病的发生。
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