20世纪90年代初，以微机电加工技术(micro-electromechanical systems，MEMS)为基础的微型全分析系统(miniaturized total analysis systems，或micro total analysis systems，μ-TAS)，在近10余年中已经发展为当前世界上最前沿的科技领域之一。μ-TAS系统也被称为芯片实验室(lab-on-a-chip)，是生物芯片的最终目标^[1]。该技术是将化学、生物学等领域所涉及的样品制备、生物与化学反应、分离和检测等过程缩微或基本缩微到一块几平方厘米的芯片上，用以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的技术，是一个微而全的系统。与相对应的宏观分析方法比较 ，该系统有很多优点。微米级通道中的高导热和传质速率及缩小的结构尺寸使其具有极高的效率，由于微流控分析的试样及试剂已降低到微升水平，减少了分析费用和贵重生物试剂的消耗，同时减少了环境污染。μ-TAS可分为芯片式和非芯片式两大类，从文献和商业开发看，芯片式是发展的重点。其中在芯片式μ-TAS中，依据芯片的结构和工作原理又可分为微流控芯片和微阵列芯片。目前微流控芯片(microfludic chip)是μ-TAS中最活跃的领域和发展前沿，用微加工技术制作的微流控芯片部件的微小尺寸使多个部件与功能集成在数平方厘米的芯片上成为可能，在此基础上容易制成功能齐全的便携式仪器，可用于各类现场分析。原则上，微流控芯片可应用于各个分析领域，如生物医学、新药物的合成与筛选、食品和商品检验、环境监测、刑事科学、军事科学和航天科学等其他重要应用领域，其中生物分析是热点。目前其应用主要集中在核酸分离和定量、DNA测序、基因突变和基因差异表达分析等。另外，蛋白质的筛分在微流控芯片中也已有报道。本文拟对微流控芯片的概念和特点作简要介绍，并对近年国内外学者利用微流控芯片进行基因分析的研究进展作一综述。

1 微流控芯片技术在基因分析中的应用 1.1 聚合酶链反应

聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一种对核酸分子进行体外扩增的方法，已经广泛应用于生物医学各个领域，反应的主要操作过程在3个温度区间重复循环，经过酶促反应扩增特定的DNA片段，扩增后的产物可用于诊断疾病、检验组织或血样中的特殊细菌或病毒。常规的PCR过程需要制样、扩增及检测等步骤，既费时又费力，而微流控芯片技术用于PCR扩增及相关检测时，既能简化操作步骤，又能显著提高检测效率。目前，反应池内固定扩增式PCR和连续流动式PCR已经成为芯片上PCR扩增的2种主要形式^[2]。前者基于静态反应，通过反应池内温度的周期性变化实现扩增，后者是依靠生物样品顺序流过3个不同的温度区实现扩增。1996年Kopp等^[3]首次提出连续流动式微流控PCR芯片，其核酸的扩增过程均在流动中进行，流动式芯片下面分别有95℃、72℃、60℃3个不同的恒温区域，样品流经此3个区域即能实现自动在同一块芯片上完成PCR的变性、退火、延伸3步反应，大大缩短了扩增的时间，同时所需的反应试剂也比传统的PCR少。此后，很多科学家在此项研究的基础上，对连续流动式PCR技术进行了更进一步的改进，使其更加微型化。1998年，Manz等^[4]首次应用玻璃基微流控芯片对176 bp的片段实现了体外连续放大，完成了20次扩增，最短仅需要1.5 min，最长需要18.7 min。Schneegass^[5]用流动型PCR扩增芯片在35 min内成功扩增了106，379和700 bp的DNA片段。姚李英等^[6]采用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)高聚物材料代替硅和玻璃作为微流控芯片的基片材料，美国Kloehn公司的精密注射泵作为进样系统，在10 nl/s的进样速度下，在20个循环的PCR微流控芯片上进行了DNA扩增实验，实验仅耗时15 min，实验时3个温区的温度分别为变性104℃，复性60℃，延伸82℃。

但在多个样品连续扩增时，由于通过人工换样，降低了单位时间扩增的样品数，也增加了交叉感染的可能。为克服以上缺陷，刘金华等^[7]研制了具有35个扩增循环的螺旋通道微流控PCR玻璃芯片，在26min内成功扩增了质量浓度仅为10 ng/ml的6012 bp的DNA。在芯片内液流由内向外流，减少了反应液在微通道中流动时的分散和阻力，将小孔径石英毛细管作为顺序注射系统(SI)的连接通路，将死体积降低至0.3 nl，从而完成了扩增过程中微升级样品的自动控制，实现了在芯片上进行多个样品的连续自动扩增、微升级样品的自动换样、连续PCR扩增和微通道洗涤等功能，样品间无交叉污染。由此可见，利用流通式微流控PCR芯片已成功地实现了PCR的快速扩增，其优点是扩增速度快，操作简便，使用样品和试剂少，芯片可以重复使用。

1.2 核酸分离与测序

微流控芯片分析在生命科学领域的主要应用对象之一是核酸分析。由于在微通道条件下，施加电场产生的焦耳热效应低，注入的试样量少，分子扩散程度低，因此，微流控电泳分析在核酸诊断分离中的分辨能力远远好于平板凝胶电泳。微芯片的快速高质量的分离效能在寡核苷酸、DNA、RNA片段分析以及基因表型和测序应用中得到充分反映。微芯片上的DNA基因型分析可以迅速完成基因鉴别，显著提高其在基因组学、诊断学、遗传药理学、法医学检验方面的性能。1994年，Effenhauser最早在微流控芯片上进行DNA分离，分离了长度为10～15 bp的DNA低聚物的混合物。尔后又陆续在微芯片电泳上进行DNA分离的基础性研究工作。Kaji^[8]等人应用纳米技术，在石英芯片的微通道内制作出纳米柱(直径100～500 nm，高约500～5 000 nm)，使用这种纳米柱作为筛网，在直流电场下可以有效地分离DNA片段(1～38 kb)以及较大的DNA分子。Baba等^[9]采用步进线性梯度凝胶方式，借助于筛分介质中孔径的差异，明显改善了DNA片段的分离。近10年来，随着微流控分析芯片在技术上的不断完善和发展，微流控分析芯片系统所能分离的DNA片段的长度也在逐步扩大，可完成对DNA片段的测序和遗传物质的分离、分析，并且出现了可同时进行平行分析的多通道阵列芯片。Mathies等^[10]在直径150 mm的圆盘式玻璃芯片上刻蚀了96条长16 cm的逶迤型毛细管电泳阵列通道，完成了4色M13标准DNA的平行分离检测，测序长度可达500个bp，分离时间却少于30 min。Lagally^[11]等开发出一种集成化DNA分析系统，首次在单个芯片上完成了聚合酶链反应-电泳(PCR-CE)的集成，建立了集取样、PCR扩增和CE分离分析于一体的微系统，不仅系统功能更强大，而且装置也更紧凑、更完善。Medintz等用96通道圆盘式阵列芯片毛细管电泳进行DNA测序，500 bp分离测序时间少于30 min，总错检率小于1%。

1.3 多态性检测

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)就是人类基因组中物理图谱的理想遗传标记，能满足对代谢、生长和疾病相关基因的定位。SNP在人类基因组中出现的频率非常高，平均每500～1 000个碱基对中就有一个SNP，估计其总数在300万个以上^[12]。基因多态性是人类各种可遗传变异中常见的现象，主要表现为长度和序列多态性两个方面。长度多态性包括大片段DNA插入或缺失引起的基因突变以及高度重复序列中小卫星或微卫星位点的重复串联数目不同而引起的多态性;而序列多态性则来源于单碱基的替换、插入或缺失，也叫基因的点突变。病态下许多突变涉及到大范围的基因缺失或复制。如杜氏肌营养不良(DMD)是一种X染色体连锁的隐性遗传病，60%的患者可伴有抗击萎缩蛋白基因的缺失，且主要发生在9个突变热点区。SNP检验方法主要是以PCR为基础，通过电泳技术分辨碱基差异造成的DNA片段的各种差异来进行基因分型。Cantafora等^[13]通过Agilent 2100芯片分析仪，以低密度脂蛋白受体基因D19s394位点的四核苷酸重复序列(AAAG)为遗传标记，对70名家族性高胆固醇血症携带者和100名正常人进行了基因分型，并进行了家族性连锁分析，其核心序列的重复数目为0～17不等，等位基因判断的标准偏差为(±0.6～±0.75)bp。Liu DY研究组将PCR扩增与毛细管电泳分离集成在玻璃微流控芯片上，用激光诱导荧光(LIF)检测，建立了一个用于严重急性呼吸系统综合征(SARS)冠状病毒的实验系统，和常规的PCR-平板凝胶电泳比较，该系统检测灵敏度提高100倍。宋沁馨^[14]等用芯片电泳快速检测人p53基因外显子8上的突变点，采用芯片电泳检测结合特异性引物单碱基延伸法(SBE)，除去SBE反应时间，芯片电泳可在100 s内检测出结果，简便而又准确。Lu CY等^[15]在PCR和限制性核酸内切酶消化操作后, 用Agilent 2100芯片分析仪的DNA500和 DNA1000试剂盒相关程序分析DNA点突变，与传统的用凝胶电泳限制性片段长度多态性分析方法相比, 优点为灵敏度高重复性好。汪洋等^[16]利用微流控芯片检测p16基因的异常甲基化。通过对肺癌患者血浆标本的检测，使病人血浆中的p16基因甲基化的异常改变可能成为辅助肺癌早期诊断和高危人群筛选的分子标记物，以期建立一种崭新而可靠的早期肺癌临床诊断标准。Steven等^[17]采用以聚碳酸酯(PC)制作的连接酶检测反应器(LDR)及PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)制作的微通道为主要部件的微流控芯片，对大量样本DNA中可能发生点突变的序列进行了检测，达到了预期的效果，处理一个样本只需要约19.1 min。

1.4 其他

除了应用于基因多态性检测和DNA测序，芯片电泳还可通过PCR产物分析进行外源性病原体基因的快速检测，并具有较高的灵敏度和特异性。针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体DNA的序列多态型、基因变异的位点及特征等，设计和选择合适的核酸探针，经PCR扩增后检测，就能获得病原微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息，为疾病的诊断和治疗提供一个很好的切人点。有关该技术的应用已有报道，应用微流控芯片可同时检测多种病原微生物核酸的PCR产物如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒等，如卞茂红等^[18]应用PCR-微流芯片检测无偿献血者的初、复检合格血液的混合血清HBV DNA ，对献血者进行更为有效的筛选，从微流芯片法重复定量检测结果来看，该方法的重复性好，结果稳定且特异性强，检测速度快，一般3 h左右能完成操作的全过程，有助于减少甚至避免输血传播疾病的发生。Noerholm等^[19]研制了一种高分子材料的微流控-微阵列芯片，可以用于核酸杂交并对其进行实时检测。该芯片具有一个进样口，一个可容纳1 000点微阵列的杂交室、一个废液池和一个通气口。探针DNA分子是通过微阵列技术印制到基体表面的，所要分析的样品由微流控体系加入并与探针反应。该技术吸收了微流控与微阵列两者的优点，微流控体系可以通过调节温度自动控制与微阵列DNA反应的样品量，同时吸取了微阵列技术中可通过荧光信号对杂交进行实时监测的长处。

2 展望

经过十几年的发展，微流控分析芯片技术在基因分析中的应用越来越广泛，并不断取得积极和具有突破性的成果，并由于自身突出的优点，可能在不远的将来成为基因分析的主要工具，其技术可以为后基因时代的基因组学研究提供一个更为强大的平台。但在一项新技术高速发展的同时，既存在着优势，也面临着限制其发展的不利因素。目前，微流控芯片的集成度仍不够高，多数检测器的体积过大，实现集成化还有很长的路要走。在目前加工条件下微流控芯片的成本较高，还难以满足有关成果推广应用的要求。当前报道的大部分微流控芯片分析系统功能仍不够全，不包括试样的前处理功能，如何解决实际试样的分析，更好地利用现有的微机电加工技术(MEMS)和μ-TAS技术，发展实用性的芯片分析平台，需要进一步研究。