中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (7): 798-800   PDF    
引用本文
李彦荣, 应晨江, 易海维, 衣卫杰, 孟依, 刘烈刚, 孙秀发. 绿茶多酚对牛内皮细胞窖蛋白-1表达影响[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(7): 798-800.
LI Yan-rong, YING Chen-jing, YI Hai-wei, et al. Influence of green tea polyphenols on caveolin-1 expression in bovine endothelial cells[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(7): 798-800.
绿茶多酚对牛内皮细胞窖蛋白-1表达影响
李彦荣, 应晨江, 易海维, 衣卫杰, 孟依, 刘烈刚, 孙秀发     
华中科技大学同济医学院公共卫生学院营养与食品卫生系, 武汉 430030
收稿日期: 2006-10-17
基金项目: 国家自然科学基金 (30471461)
作者简介: 李彦荣 (1980-), 女, 河北石家庄人, 硕士在读, 研究方向:营养食品与健康。
摘要： 目的 探讨绿茶多酚 (GTPs) 对牛内皮细胞窖蛋白-1(Cav-1) 表达的影响。 方法 以体外原代培养的牛主动脉内皮细胞 (BAECs) 为研究对象; 以4μg/ml的绿茶多酚分别作用于牛内皮细胞0, 4, 8, 12, 16和24 h, 免疫印迹方法观察Cav-1的蛋白水平变化; RT-PCR检测窖蛋白-1的mRNA表达水平变化。 结果 Cav-1蛋白和mRNA表达水平在4μg/ml GTPs作用4 h开始下降, 可以维持到8 h, 在12 h后Cav-1蛋白和mRNA恢复到正常水平。 结论 绿茶多酚可降低内皮细胞窖蛋白-1的蛋白和mRNA表达, 并且有时效性, 可能是茶及其多酚改善内皮功能和预防心血管疾病的分子机制之一。
关键词： 茶多酚     内皮细胞     窖蛋白    
Influence of green tea polyphenols on caveolin-1 expression in bovine endothelial cells
LI Yan-rong, YING Chen-jing, YI Hai-wei, et al     
Department of Nutrition and Food Hygiene, School of Public Health, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430030, China
Abstract: Objective To investigate the influence of green tea polyphenols (GTPs) on caveolin-1(Cav-1) expression in bovine endothelial cells in the level of cell and molecular initially. Methods In vitro, primary cultured bovine artery endothelial cells (BAECs) were treated with 4 μg/ml GTPs for 0, 4, 8, 12, 16 and 24 hours, respectively.After protein and RNA extracted from treated cells, the Cav-1 protein and mRNA levels were detected by Westem Blot and RT-PCR methods. Results After BAECs co-incubated with 4 μg/ml GTPs for 4 hours, the expression of Cav-1 protein and mRNA decreased.The down-regulation effect of GTPs can maintain 4 hours and protein and mRN A expression of Cav-1 regained to normal level after 8 hours. Conclusion GTPs can decrease the protein and mR NA expression of Cav-1 in endo thelial cells, and the influence of GTPs may be chronergy.It may be the molecular mechanism of tea amelioration endo thelial function and prevention CVD.
Key words: tea polyphenols     endotheliocyte     caveolin    

胞膜窖 (caveolae) 是胞膜上直径约50~100 nm，富含胆固醇、鞘磷脂和鞘磷糖的烧瓶状膜内陷区域[1]。窖蛋白-1(Caveolin-1, Cav-1) 是胞膜窖的标志性蛋白，并且在细胞信号转导中发挥主宰调节者作用。绿茶多酚 (GTPs) 是茶叶中的主要活性成分，具有抗癌、清除氧自由基、抑制血压升高、降低心血管疾病危险性等作用[2]。但绿茶多酚长时间作用内皮细胞产生有益作用的机制还不清楚。本试验旨在探讨茶多酚对内皮细胞窖蛋白-1基因表达水平的影响，为茶多酚预防心血管疾病机制的研究提供依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

绿茶茶多酚 (荷兰联合利华健康研究所)；Dulbecco改良Eagle's培养基 (DMEM) 低糖培养基 (德国Sigma公司)；胎牛血清 (美国Gibco公司)；蛋白定量试剂盒、电泳和转膜装置 (美国Bio-Rad公司)；增强化学发光剂 (ECL) 和显影暗盒 (英国Amersham公司)；显影胶片 (英国宝丽莱T667胶片)；窖蛋白-1抗体 (美国Santa Cruz公司)；辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗 (美国Sigma公司)；PCR仪和图像分析仪 (德国Biometra公司)。

1.2 方法 1.2.1 细胞培养

参照司徒镇强[3]的方法，加入 (DMEM培养基) 和10%的胎牛血清接种于培养皿中，培养于5%的CO2，37℃饱和湿度的培养箱中，2 d后换液。

1.2.2 内皮细胞的鉴定

(1) 在倒置显微镜下观察培养细胞的形态特点；(2) 内皮细胞中特异表达第Ⅷ因子按文献[4]方法，采用常规ABC免疫酶染色法鉴定牛主动脉内皮细胞 (BAECs)，一抗1:20湿盒中4℃过夜，空白对照一抗用磷酸盐缓冲液 (PBS) 代替，显色后在显微镜下观察。

1.2.3 绿茶多酚处理细胞

当细胞长到80%时，DMEM培养基加入4 μg/ml的绿茶茶多酚分别作用细胞0，4，8，12，16和24 h，每组中随机选取3皿细胞刮下加入细胞裂解液处理，另外3皿细胞加入Trizol处理提取mRNA。

1.2.4 免疫印迹检测窖蛋白-1的蛋白表达水平

细胞用细胞裂解液溶解后提取全细胞蛋白。经蛋白质定量、蛋白质电泳分离 (SDS-PAGE) 和免疫印迹按参考文献[5]的方法进行。免疫反应带用ECL试剂盒检测，化学发光信号用自显影胶片记录，扫描仪扫描，用Biometra图像分析仪对条带积分吸光度进行定量分析。

1.2.5 RT-PCR检测窖蛋白-1的mRNA水平

按照Trizol说明书方法提取细胞mRNA。在25 μl逆转录反应体系中，以1.0 μgmRNA为模板将mRNA逆转录为cDNA。PCR反应以甘油醛-3-磷酸脱氢酶 (GAPDH) 为内参，GAPDH上游引物为5'-atgaccactgtccacgccat-3'，下游引物为5'-tacaagccaacaacaagg-3'，下游引物为5'-acagtgaaggtggtgaagc-3'，反应产物209 bp。PCR反应体积为25 μl，反应条件为：94℃变性1 min，59℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30个循环。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳并与DNA标准比较，然后在数字成像仪上照相分析。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.0软件进行组间方差分析。

2 结果 2.1 牛主动脉内皮细胞的形态学观察

在倒置显微镜下，可见牛主动脉内皮细胞第3 d开始贴壁，呈梭形，第7 d生长融洽，呈铺路石样镶嵌单层排列，胞核卵圆形居中，胞浆透明，胞膜清晰，边缘光滑。

2.2 第Ⅷ因子鉴定 (图 1、图 2)

在光学显微镜下培养的传代细胞的胞质可见黄褐色的颗粒沉淀及淡蓝色胞核，对照组可见胞核呈淡蓝色，胞浆透明，无颗粒。由此细胞中第Ⅷ因子表达阳性，证明培养的细胞确为内皮细胞。

图 1 BAEScⅧ因子相关抗原表达阳性 (×400)

图 2 BAEScⅧ因子相关抗原表达阴性对照 (×400)

2.3 绿茶多酚作用后窖蛋白-1的基因表达水平 (表 1，图 3，图 4)

4 μg/ml的绿茶多酚作用于牛内皮细胞，与0 h相比，4 h窖蛋白-1的蛋白降到最低，8 h时有所增加，但仍比0 h低 (P＜0.05)，而窖蛋白-1的mRNA 4 h开始下降 (P＜0.05)，8 h降到最低 (P＜0.05)，12，16，24h的窖蛋白-1的蛋白和mRNA表达与0 h比较，差异无统计学意义 (P＞0.05)。

表 1 绿茶多酚作用于牛内皮细胞窖蛋白-1表达水平 (x±s，n=3)

图 3 绿茶多酚作用于牛内皮细胞窖蛋白-1的蛋白表达水平

图 4 绿茶多酚作用于牛内皮细胞窖蛋白-1的mRNA表达水平

3 讨论

近年来研究表明，血管内皮细胞并非单纯管腔内衬，它还有复杂的内分泌功能。内皮细胞胞膜上存在50~100 nm的内陷 胞膜窖。窖蛋白-1位于胞膜窖，是胞膜窖的结构决定性蛋白，包含一个被称为窖蛋白绞手架区 (caveolin scaffolding domain, CSD) 的功能域，它是窖蛋白与胞内其他信号分子相互作用的区域[1]。许多信号分子 (G蛋白、激酶等) 与窖蛋白-1结合，这种结合可以让这些信号分子处于静止或抑制状态。例如产生NO的eNOS就位于eavcolin-1脚手架区，使其处于无活性状态[6]。

已有研究表明，红茶多酚可以增加内皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 的活性和表达[7]，并且我们的前期实验也表明绿茶多酚可以增加eNOS的蛋白表达和mRNA含量，而窖蛋白-1作为eNOS的上游抑制分子[6]，推测可能会有所降低。本实验研究表明，绿茶多酚可以降低牛内皮细胞的窖蛋白-1蛋白表达和mRNA水平，因此，初步推断绿茶多酚可以通过窖蛋白-1来调节eNOS的活性和表达。茶多酚抑制窖蛋白-1可能有多种机制。已有报道，茶多酚可以通过p38和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2) 来激活eNOS[6]，同时ERK1/2可以抑制窖蛋白-1的表达和磷酸化，所以茶多酚很有可能是通过丝裂素活化蛋白激酶 (MAPK) 途径来调控窖蛋白-1的表达，但还需进一步研究。

参考文献
[1] Schwencke, Braun-Dullaeus, Wunderlic, et al. Caveolae and caveolin in transmembrane signaling:Implication for?human disease[J]. Cardiovascular Research, 2006, 70(1) : 42–49. DOI:10.1016/j.cardiores.2005.11.029
[2] Tiziana Bachetti, Lucia Morbidelli. Endothelial cells in cultrue:a?model for studying vascular functions[J]. Pharmacological Research, 2002, 42(1) : 9–18.
[3] 司徒镇强, 吴军正. 细胞培养[M]. 西安: 世界图书出版社, 1996: 119-120.
[4] Jaffe EA, Hoyer LW, Nachman RL. Synthesis of antihemophilic factor antigen by cultrued?human endothelial cells[J]. J Clin Inves, 1973 : 52.
[5] 苗升浩, 孙秀发, 应晨江. 虾青素对内皮细胞过氧化物酶和超氧化物歧化酶-1表达的影响[J]. 华中医学杂志, 2004, 28 : 79–80.
[6] . Activation of endothelial nitric-oxide synthase by the p38 MAPK in Response to black tea polyphenols[J]. Journal of Blological Chemistry, 2004, 279(45) : 46637–46643.