苦瓜作为一种药食兼用的草质藤木植物的果实, 民间食用已有数百年历史, 其药用价值越来越被人们所关注。随着研究的深入, 人们发现苦瓜有较多的保健作用^〔1-3〕和广阔的临床应用前景。对苦瓜的毒性研究发现, 苦瓜对雄性动物具有较强的抗生育活性^〔3〕。国内外学者采用不同方法对苦瓜食用部分进行了分离提取及鉴定, 从苦瓜中曾分离出苷类、蛋白质、多肽、氨基酸、糖类、生物碱类、有机酸、脂类、甾类、萜类、微量元素等多种化学成份^〔4〕。由于提取方法不同, 导致苦瓜提取物成分各异, 不同提取物的生物学作用亦不同。因此, 本实验观察了苦瓜提取物对雄性小鼠精子的影响, 旨在为更好地开发利用苦瓜系列产品提供科学依据。现报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 苦瓜水提取物

由湖南师范大学化学测试分析中心提供。

1.1.2 实验动物及饲养

清洁级昆明种小鼠, 体重25~35 g (南华大学实验动物学部); 实验动物生产许可证号为SCXX (湘) 2004-0009, 实验动物使用许可证号为SYXK (湘) 2003 -0002。实验期间动物房环境温度为21~24 ℃, 湿度为56 %~58 %。

1.2 方法^〔5〕

将25只小鼠随机分为5组, 每组5只。试验组设10 000, 5 000, 2 500 mg/(kg· bw) 3个剂量, 采用40 mg (kg· bw)剂量的环磷酰胺为阳性对照, 蒸馏水为阴性对照, 小鼠按20 ml/(kg· bw)体积灌胃, 每日1次, 连续5 d, 于末次灌胃后的第30 d处死动物, 取两侧副睾, 按文献〔5〕制备精子悬液。

1.2.1 精子计数^〔6〕

将精子悬液滴入细胞计数池内, 用高倍镜计数中央大格内5个中方格的精子数, 结果乘以10⁹即为每升悬液中的精子数。

1.2.2 精子活动率^〔6〕

于(20±2) ℃的室温下, 在10 min内完成每只鼠1 000个左右精子活动力的观察, 取悬液滴片, 显微镜下将精子活动状态分为4级: Ⅰ:运动活泼, 直线运动; Ⅱ:运动欠活泼, 直线游动; Ⅲ:原地旋转, 动作迟缓; Ⅳ:毫无活力, 并按下式计算精子活动率:

1.2.3 精子存活率

采用伊红试验^〔7〕。取精子悬液和0.5 %伊红水溶液各1滴混合, 在1 min内高倍镜检查。活的精子不着色, 死的精子染成淡红色或淡黄色, 计算存活率。

1.2.4 精子形态学观察^〔5〕

将精子悬液用4层擦镜纸过滤, 吸滤液涂片, 干燥后甲醇固定5 min, 2 %伊红染色1 h, 用水轻冲、干燥。每只动物计数1 000个结构完整的精子, 计算畸变精子发生率。

1.3 统计分析

数据进行χ²检验。

2 结果 2.1 苦瓜水提物对小鼠精子计数的影响

2 500, 5 000, 10 000 mg/(kg· bw)剂量组小鼠精子数分别为(76.20±26.37), (56.40±15.11), (61.40±11.10) ×10⁹/ml, 对照组为(78.40±45.86) ×10⁹/ml。单因素方差分析显示, 4组精子计数总体比较差异无统计学意义(P > 0.05)。

2.2 苦瓜水提物对小鼠精子存活率的影响

2 500, 5 000, 10 000 mg/(kg· bw)剂量组小鼠精子生/死比例分别为0.934, 0.794, 0.863, 对照组为1.383, χ²检验显示, 3个剂量组小鼠精子生/死比例较对照组显著减低(P < 0.001)。

2.3 苦瓜水提物对小鼠精子活动度的影响(表 1)

χ²检验显示, 5 000, 10 000 mg/(kg· bw)剂量组较对照组小鼠精子活动率显著升高(P < 0.001)。

2.4 小鼠精子形态学观察(表 2)

χ²检验显示, 各试验组精子畸形率与阴性对照组比较差异无统计学意义(P > 0.05), 而各试验组和阴性对照组精子畸形率显著低于环磷酰胺组(P < 0.01)。提示苦瓜水提物对小鼠精子畸形发生率无明显影响。

3 讨论

本实验结果表明, (1) 苦瓜水提取物对精子的存活率有显著影响, 3个剂量组与对照组比较分别下降了9.75 %, 13.79 %, 1.172 %; (2) 苦瓜水提取物能提高存活精子的活动度, 5 000, 10 000 mg/(kg· bw)剂量组与对照组比较, 活动度有明显提高, 分别较对照组提高了9.9 %, 16.0 %; (3) 苦瓜水提取物3个剂量组精子数量虽较对照组均有下降, 但差异无统计学意义; (4) 未见苦瓜水提取物对小鼠精子形态有明显影响。本实验观察结果与覃国芳等^〔8〕、Nasseem MI等^〔9〕的报道相似, 精子存活率下降, 理论上讲可导致生育力下降; 也有不同, 即存活精子活动度增强, 精子计数未见明显下降, 畸形数未见明显增加。这可能与苦瓜提取方式、受试对象物种不同有关。

由于苦瓜水提取物成分目前还不是十分清楚, 导致精子存活率下降、存活精子活动度增加的作用机制, 有待于进一步研究。