近年来, 分枝杆菌耐药现象日趋严重, 耐多药结核分枝杆菌也日渐增多, 导致其感染的难治性。分枝杆菌内在性耐药主要是细胞壁通透性障碍, 导致药物进入高疏水性细胞壁间隙比较慢; 而获得性耐药主要是基因突变, 导致抗生素靶位变异或药物在细胞内处于无活性状态。但仅凭天然细胞壁屏障作用和基因突变因素尚不足以解释分枝杆菌耐药机制。研究表明, 分枝杆菌存在药物主动外排泵的表达, 并被视为是可能的另一种重要耐药机制^{〔1, 2〕}。现就分枝杆菌外排泵的生物学功能及其基因调控机制研究进展综述如下。

1 分枝杆菌外排泵生物学功能

研究发现, 分枝杆菌外排泵能将菌细胞内药物泵出, 使得胞内药物浓度不能有效抑制分枝杆菌生长, 从而产生抗生素耐受性^{〔3, 4〕}。药物外排系统根据其蛋白氨基酸同源性可分成很多种类^〔4〕, 结核分枝杆菌H37Rv株基因组有20个编码假想外排泵的开放阅读框(ORF)^〔5〕。目前仅有几种分枝杆菌外排泵得到一定研究, 分别为属于主要易化超家族(MFS)的LfrA、Rv1634、EfpA、Tet(V)、P55、Tap、Rv1258 c; 属于耐受小节分裂区家族(RND)的MmpL; 属于ATP结合盒超家族(ABC)的DrrAB、Pst、Rv2686 c-Rv2687 c-Rv2688 c; 属于小耐多药性家族(SMR)的Mmr等。这些药物外排泵蛋白转运氟喹诺酮类(FQs)、四环素、氨基糖苷类药物及其他化合物。

1.1 MFS类

生物信息学分析结核分枝杆菌基因组有16个ORF编码假想的药物外排泵属于MFS类^〔6〕。

1.1.1 分枝杆菌MFS外排泵转运FQs

(1)LfrA:分枝杆菌中发现的第一个功能外排泵, 具有较广的底物专一性, 但其外排作用仅限于亲水性较高的FQs。Takiff等^〔7〕从一株耐环丙沙星耻垢分枝杆菌中克隆基因lfrA, 将之转染耻垢分枝杆菌敏感菌mc²155株后, 赋予该菌对FQs低水平耐药。对LfrA蛋白氨基酸序列预测性分析显示其与属于MFS的金黄色葡萄球菌QacA蛋白同源, 推测LfrA蛋白是MFS类外排泵蛋白。Liu等^〔8〕证实, LfrA蛋白涉及几种喹诺酮抗生素的排出, 肯定了Takiff的推测。Sander等^〔9〕研究耻垢分枝杆菌lfrA基因插入失活突变株时, 也发现溴乙锭和吖啶黄最小抑菌浓度(MIC)降低, 认为可能是LfrA外排机制的作用。(2)Rv1634:Rossi等^〔10〕发现, 结核分枝杆菌H37Rv株Rv1634基因编码另一种假想的MFS类外排泵Rv1634。当它在耻垢分枝杆菌过度表达时, 赋予氟喹诺酮类药物敏感性降低。蓄积数据显示, 这个泵与氟哌酸和环丙沙星外排有关。(3) EfpA:Doran等^〔11〕发现, 结核分枝杆菌H37Rv株efpA基因编码假想外排泵蛋白EfpA, 其在蛋白二级结构上与LfrA同源。该蛋白也导致对氟喹诺酮耐药。耻垢分枝杆菌efpA基因缺失株与野生株比较, 其对溴乙锭、庆大霉素、氟喹诺酮和吖啶黄敏感性增加2~8倍, 但对利福霉素、氯霉素、异烟肼和红霉素敏感性却降低2~4倍^〔4〕。EfpA在耐药中的作用和它的底物专一性仍有待进一步研究。

1.1.2 分枝杆菌MFS外排泵转运四环素、氨基糖苷类

(1) Tet(V):Tet(V)是分枝杆菌四环素外排泵^〔12〕。四环素对临床分离的几种快速生长的偶发分枝杆菌、耻垢分枝杆菌等都有抗菌活性。tet(V)基因序列分析显示, 其与编码其他已知的革兰阳性菌四环素转运体基因相似。耻垢分枝杆菌Tet(V)外排泵的过度表达使得四环素MIC增加2~4倍, 但对四环素衍生物强力霉素和美满霉素却无影响。(2) P55:Sliva等^〔13〕根据结核分枝杆菌基因组信息, 克隆并表达了可能的外排泵蛋白Rv1410 c, 命名为P55。研究表明, P55存在于结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、鸟分枝杆菌和麻风分枝杆菌等多种分枝杆菌中。将携带P55编码基因的质粒转染耻垢分枝杆菌后, 重组细菌表现出对氨基糖苷类和四环素耐药。在泵抑制剂碳酰氰基-对-氯苯腙(CCCP)和维拉帕米作用下, 其耐药性降低。表达P55的耻垢分枝杆菌胞内四环素蓄积量明显小于对照株。故推测P55蛋白是分枝杆菌中执行氨基糖苷类和四环素外排泵功能的蛋白。(3) Tap:Ainsa等^〔14〕从偶发分枝杆菌基因组中克隆tap基因, 将之转染mc²155后, 表现出低水平耐氨基糖苷类和四环素。蛋白结构分析, Tap有20%~30%氨基酸序列与MFS家族成员特别是四环素和大环内酯类泵蛋白一致。其底物包括四环素和某些氨基糖苷类药物。Martin等^〔15〕也发现, Tap蛋白利用跨膜电化学梯度将四环素从胞内挤出。这种外排活性被CCCP和利血平抑制, 这一结果与在有这些抑制剂存在时的MIC下降一致。(4) Rv1258 c:结核分枝杆菌Rv1258 c基因与偶发分枝杆菌tap基因同源。Siddiqi等^〔16〕研究临床分离耐多药结核分枝杆菌株ICC154时发现, Rv1258 c转录水平明显上升, 与结核分枝杆菌对四环素内在性耐药有关。根据其以往的研究^〔17〕, 排除了ICC154基因突变所致, 认为可能是Rv1258 c基因过度表达所致。

1.2 RND类

结核分枝杆菌基因组序列包含编码可能的预测属于RND家族转运体蛋白的跨膜蛋白的15个基因, 这些编码于分枝杆菌的蛋白命名为MmpL(mycobacterial membrane proteins, large)。Pasca发现^〔18〕, mmpL 7基因在耻垢分枝杆菌表达时对异烟肼高度耐药, 该耐药在利血平和CCCP存在时有所减弱。另外在耻垢分枝杆菌在能量依赖型外排异烟肼也能检测到有mmpL基因表达。

1.3 ABC超家族

编码ABC转运体的基因占结核分枝杆菌基因组约2. 5%。至少有37个完整或不完整ABC转运体已经在结核分枝杆菌中发现^〔19〕, 其作用底物非常广泛, 包括FQs、利福平、四环素、红霉素等。

1.3.1 DrrAB

结核分枝杆菌基因组中有阿霉素耐药操纵子drrAB。麻风分枝杆菌和鸟分枝杆菌中也存在同源基因。2个转录成对的开放阅读框drrA、drrB可编码ABC转运体。drrA编码核苷酸结合区域, drrB编码细胞膜上蛋白亚基。其具有泵功能的结构是drrA₂B₂。drrA结合于细胞膜依赖于drrB的同时表达。在缺失drrA时, drrB很容易被蛋白水解酶水解, 两者同时表达, 才能形成具有功能的药物外排泵。Choudhuri^〔20〕研究发现, drrAB在耻垢分枝杆菌中表达时, 表现出对利福平、四环素、红霉素等一系列临床常用抗生素耐药。用泵抑制剂处理后, 耐药明显受到抑制, 说明DrrAB在结核分枝杆菌耐药中存在作用。

1.3.2 Pst

磷酸盐转运体Pst (phosphate specific transporter)存在于多种微生物, 主要涉及磷酸盐运输, 现发现其可能还与胞内氟喹诺酮外排有关。Banerjee^〔21〕认为, Pst能将胞内的氟喹诺酮排出胞外, 耻垢分枝杆菌耐环丙沙星突变株受氟喹诺酮类抗生素作用48h后, Pst系统中编码PstB (ATP酶亚基)的mRNA水平明显升高。而PstB的失活将导致菌株对氟喹诺酮非常敏感。Poole^〔22〕也证实, 耻垢分枝杆菌Pst高表达导致环丙沙星耐药, 而用外排泵抑制剂维拉帕米可逆转此耐药。

1.3.3 Rv2686 c-Rv2687 c-Rv2688 c

Pasca等^〔23〕研究表明, 结核分枝杆菌H37Rv株基因组中存在一个编码属于ABC转运子家族的氟喹诺酮排出泵蛋白的操纵子, Rv2686 c-Rv2687 c-Rv2688 c, 这3个基因是共同表达的。研究该蛋白功能发现, 其过度表达的耻垢分枝杆菌, 环丙沙星高度耐药。而仅Rv2686 c过度表达时, 环丙沙星中度耐药。对诺氟沙星则不管是表达完整的操纵子还是仅为Rv2686 c, 突变株低水平耐药。对这一现象, Pasca分析可能是由于Rv2686 c蛋白与宿主细胞内相关蛋白相互作用, 形成一个药物转运体的缘故。用利血平和维拉帕米处理, 则可以诱导环丙沙星MIC降至与野生株一致的水平, 表明该转运体发挥有主动外排药物的作用。

1.4 SMR家族

在分枝杆菌的SMR家族中, 目前仅找到mmr基因^〔24〕。它存在于结核分枝杆菌、牛结核分枝杆菌、海洋分枝杆菌等分枝杆菌染色体基因组中。蛋白序列对比程序BLASTP分析显示, Mmr蛋白同SMR外排家族中的QacE、EmrE等蛋白同源程度很高, 也有4个跨膜片段。将结核分枝杆菌的mmr基因转染至mc²155, 显示出对红霉素和溴乙锭等耐药, 而对利福平和链霉素等则无影响。

2 分枝杆菌外排泵相关基因调控机制

外排泵基因通常是一个操纵子的一部分, 其表达受一个调节基因控制, 过度表达可能有害是因为其表达后直接地、自然地破坏了膜融合或是不必要地输出了必需代谢产物。对于分枝杆菌外排泵的有关调控机制, 目前仅在耻垢分枝杆菌LfrA和结核分枝杆菌P55有初步研究。

2.1 LfrA/LfrR操纵子

Li Xian^〔4〕发现, 编码LfrA外排泵的基因lfrA的表达受抑制基因lfrR调控。lfrA基因上游区域的序列分析显示存在一个编码推测为含195个氨基酸的多肽的ORF, LfrR。lfrR和lfrA被认为组成一个操纵子。最近Buroni^〔25〕也证实, LfrR是调控耻垢分枝杆菌外排泵LfrA表达的抑制子。lfrR基因编码可能的四环素外排泵TetR家族转录抑制子^〔4〕, lfrR基因缺失显示lfrA表达增强, 增加了突变菌株对环丙沙星、氟哌酸、溴乙锭和吖啶黄的耐药性。LfrA的这种表达增强对高耐药株的形成具有重要作用, 推测可能是lfrA高表达增加了高水平耐药突变的频率^{〔7, 8〕}, 因其容许在低耐药浓度中存活而选择继发的高耐药突变, 比同步选择双突变的频率高, 而其他无关的突变更加频繁, 这可能是细菌如何进行性成为高耐药、多耐药的机制提供一种模式。

2.2 P27/P55操纵子

牛分枝杆菌基因组中, P55基因位于编码免疫原性脂蛋白P27基因下游区^〔13〕。Bigi F^〔26〕等在研究P55外排泵蛋白时, 采用Northern blotting和RT-PCR证实P27和P55组成一个转录单位, P27/P55操纵子。近期研究发现^〔27〕, 编码P27/P55操纵子的基因lprG-Rv1410的敲除可导致结核分枝杆菌减毒作用的发生。Silva^〔13〕等检测了质粒pPAZ24(有一个链霉素耐药Ω盒子序列插入P27基因序列, 从而阻碍了操纵子启动子作用下P55的转录)。结果显示, P55在盒子和P55起始密码子之间约390个核苷酸处有一个启动子。某些细菌有药物传感器蛋白, 可诱导与之相连的外排泵蛋白基因的表达。在这些情况中, 编码药物传感器蛋白的基因和外排泵蛋白基因彼此相邻。因为脂蛋白被认为参与信息转导, 他们推测P27也是特殊信号传感器的一种, 直接或间接激活P55的表达。当然这还需要进一步研究。

3 结语

综上所述, 外排泵赋予一种或几种药物耐受性的研究已经在分枝杆菌中得以证实。但是, 这些研究多限于野生株及其实验突变株, 有关泵的底物与耐药表型的关系还未完全明确。已发现的分枝杆菌外排泵对耐多药表型的作用及其表达调控等一系列问题需进一步阐明。从目前的研究来看, 如果编码这些外排泵蛋白的基因或相关调控基因发生突变, 可能导致外排泵高表达, 从而导致耐药性的增加。因此, 加强分枝杆菌外排泵的基础研究, 尤其是对结核分枝杆菌全基因组中假想的药物外排蛋白功能进行鉴定, 必将为阐明结核分枝杆菌耐多药性发生机制和新型药物的开发产生影响。由此也将对改进药物设计、避免药物成为外排泵的底物、增加药物的持续内流、找到更有效的外排泵特异抑制剂均有重要意义, 为临床更好地选择抗生素和有效地进行疾病治疗提供理论基础。