镍是机体生命活动所必需的微量元素, 其生物学作用极为广泛, 但其化合物又是当前主要的职业危害因素和环境污染物之一。过量镍的摄入可造成机体多系统、多器官损伤^〔1〕, 同时也是一种比较明确的致癌剂^{〔2, 3〕}。动物实验发现, 大剂量的镍及其化合物对雄性实验动物生殖功能具有毒性损害作用, 镍可透过血-睾屏障, 蓄积在睾丸组织中^〔4〕, 引起睾丸生精代谢障碍, 精子生成减少, 形态发生改变, 畸形率升高^〔5〕, 并可引起雄性大鼠性激素水平的改变^〔6〕。研究发现, 镍可致大鼠血清、肌肉、肝脏和肾脏中脂质过氧化物(LPO)含量升高, 并引起抗氧化酶活性的改变^{〔7, 8〕}。因此, 本文从线粒体和微粒体的氧化损伤角度探索镍对睾丸生殖细胞损伤的机制, 为镍致雄性生殖毒性的防治提供理论依据。

健康Wistar雄性大鼠, 体重180~220 g (兰州大学实验动物中心)。

硫酸镍(NiSO₄), 分析纯(西安化学试剂厂)。脂质过氧化物(LPO)、总抗氧化能力(T-AOC)、活性氧(ROS)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。Dptima^TM XL-100K型高速冷冻离心机(美国Meckman公司)。722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)。SHA-B型水浴恒温振荡器(常州国华仪器厂)。

健康Wistar雄性大鼠32只, 随机分为4组:对照组(NS), 硫酸镍1.25, 2.50, 5.0 mg/kg组。连续腹腔注射染毒30 d, 1次/d, 自由摄食饮水。

(1)组织匀浆的制备:染毒结束次日, 颈椎脱位法处死大鼠, 迅速摘取双侧睾丸, 称重后取双侧睾丸, 去包膜, 放入表面皿中剪碎, 加入匀浆介质(0.01 mol/L Tris-HCl缓冲液, pH7.4), 用玻璃匀浆器制成10%(w/v)的睾丸组织匀浆。(2)线粒体的制备:取10%的组织匀浆, 用低温冷冻离心机1 500 r/min离心10 min, 弃沉淀, 上清液再重复离心1次, 弃沉淀, 留取上清液用低温高速冷冻离心机12 000 r/min离心15 min, 沉淀物即为线粒体。(3)微粒体的制备:取分离线粒体后的上清液, 用高速冷冻离心机40 000 r/min离心30 min, 沉淀物即为微粒体。将分离提取的线粒体和微粒体分别用冰冷的匀浆介质制备成混悬液, 超声破膜后待用。

每个样品检测2个平行样, 严格按照试剂盒说明书测定睾丸细胞线粒体和微粒体中LPO、T-AOC、ROS的水平。

采用SPSS 10.0软件进行单因素方差分析, 并进行两两比较。

表 1

表 1 NiSO4对大鼠睾丸细胞线粒体中LPO、T-AOC、ROS的影响(x±s)

表 1 NiSO4对大鼠睾丸细胞线粒体中LPO、T-AOC、ROS的影响(x±s)

染毒早期动物出现轻微的兴奋表现, 染毒中期有精神萎靡, 行动迟缓, 毛发蓬松, 拖尾等现象, 染毒后期个别动物出现腹泻症状, 至染毒结束时未发现动物死亡情况。睾丸大体形态观察发现, 硫酸镍2.5 mg/kg组大鼠睾丸组织出现充血、水肿等现象, 脏器系数略大于其他各组(P > 0.05)。5.0 mg/kg组睾丸脏器系数降低, 与NS组比较, 差异无统计学意义(P > 0.05)。

由表 1可见, 与对照组比较, 染毒组大鼠睾丸细胞线粒体中T-AOC降低(P < 0.01), LPO和ROS含量升高(P < 0.05)。

表 2

表 2 NiSO4对大鼠睾丸细胞微粒体中LPO、T-AOC、ROS的影响(x±s)

表 2 NiSO4对大鼠睾丸细胞微粒体中LPO、T-AOC、ROS的影响(x±s)

由表 2可见, 染毒组大鼠睾丸细胞微粒体中T-AOC降低(P < 0.01), LPO和ROS含量升高(P < 0.05)。

本实验结果表明, 硫酸镍腹腔注射染毒后, 大鼠睾丸细胞线粒体的氧化应激效应增强, 提示此时线粒体产生过量ROS, 引发链式脂质过氧化生成大量的LPO, 同时抑制T-AOC活性, 引起线粒体内膜跨膜电位的下降, 导致线粒体膜通透性发生变化, 甚至出现线粒体DNA的广泛损伤^〔9〕, 进一步引起睾丸生殖细胞的损伤。本文结果显示, 镍可导致微粒体氧化应激效应增强, 引起微粒体膜的损伤及其氧化酶类活性的变化, 造成睾丸细胞的损伤。

研究发现^〔10〕, 镍可导致大鼠睾丸组织匀浆中ROS、LPO和T-AOC水平的改变。Kodipura等报道^〔11〕, 镍可导致小鼠睾丸组织细胞匀浆、线粒体和微粒体中LPO含量升高, 抑制谷胱苷肽过氧化物酶和S-转移酶活性, 使乳酸脱氢酶活性升高, 与本次实验结果一致。因此, 本实验结果提示, 线粒体和微粒体氧化应激水平的增强可能是镍致睾丸细胞损伤的机制之一。