卵黄囊抗体即卵黄免疫球蛋白(Egg Yolk Immunoglobu-lin, IgY)是抗原免疫禽类后由卵黄中分离得到的特异性抗体。与哺乳动物来源的IgG比较, 卵黄囊抗体具有取材方便、分离纯化方法简单、产量高, 同时具有特异性高、稳定性较好等优点, 在疾病诊断、防治等诸多方面得到了广泛的应用, 一直是生命科学相关科研领域的研究热点。本文就卵黄囊抗体的分离纯化方法及其应用研究进展作一综述。

1 卵黄囊抗体的基本结构及其性质

与哺乳动物血清免疫球蛋白相似, 卵黄囊抗体的基本结构包括2条轻链和2条重链, 分子量约为180 kD。卵黄囊抗体的疏水性大于IgG。Lee和Kim等^{〔1, 2〕}研究表明, 卵黄囊抗体具有良好的稳定性, 对pH及酶等作用引起的失活效应有较强的抵抗力。

2 卵黄囊抗体的制备 2.1 实验动物的免疫

Schwarzkopf等^〔3〕研究结果表明:经皮下注射的方法比肌肉注射能产生更高滴度的抗体, 免疫间隔时间对抗体的产生影响较大。通常, 初次免疫与第一次加强免疫之间的时间间隔至少4周。另有研究分别于第0 d, 10周及15周免疫产蛋鸡, 获得了高达1:160000的抗体滴度。

2.2 卵黄囊抗体的分离

从卵黄液中分离卵黄囊抗体的关键是除去卵黄中高含量的脂肪及脂蛋白, 以获得水溶性组分(Water Soluble Fraction, WSF)。根据纯度要求、技术工艺以及对环境的影响等因素, 可以选择不同的分离方法。常见分离方法包括以下几种。

2.2.1 水稀释法

先将卵黄液用蒸馏水稀释10倍, 调整pH值至5.0~5.2, 4℃静置6 h以上, 上清液即为水溶性组分。水稀释法工艺简单, 若采用适当的方法进行纯化, 可获得较高的回收率和纯度。

2.2.2 有机物沉淀法

聚乙二醇(PEG)法是较常用的方法。Bizanov和Normantiene^〔4〕用仙台病毒免疫产蛋母鸡, 收获高免鸡蛋。以TBS作为缓冲液, 将卵黄液稀释4倍后, 加入3.5%的聚乙二醇6 000, 沉淀脂类, 卵黄囊抗体保留在上清液中。应用这种方法从每毫升卵黄液中获得约4.5 mg的特异性卵黄囊抗体, 纯度达95%。

2.2.3 有机溶剂抽提法

脂类易溶于有机溶剂, 可采用氯仿、丙酮等有机溶剂进行分离。用经TBS冲洗过的鸡蛋黄制成15 ml蛋黄液, 加入40 ml TBS充分混匀后加入40 ml氯仿, 冷冻离心, 分三相。弃去氯仿层, 保留水层, 中间的半固体相用40 ml TBS萃取, 取水层, 与前一步水层合并即为水溶性组分。

2.2.4 天然胶法

一些天然胶如卡拉胶和黄原胶等可用于卵黄抗体分离。将9倍体积的0.1%(w/v)卡拉胶溶液与卵黄混合, 离心得到水溶性组分。也可将卵黄先用双蒸水稀释1倍后再与4倍体积的黄原胶混匀, 离心即得水溶性组分。使用天然胶法去除脂类效果较好, 获得的水溶液中脂类含量少于0.4%。

2.2.5 中链脂肪酸法

辛酸是用于卵黄囊抗体分离最常用的中链脂肪酸。蛋黄用去离子水稀释7.5倍, 混匀, 离心, 上清液再用醋酸盐缓冲液稀释2倍, 调pH值至5.0, 加辛酸至终浓度为1%, 静置分层, 卵黄囊抗体在水层中。

2.2.6 去污剂分离法

Sriram等^〔5〕比较了几种去污剂包括阴离子、阳离子和非离子型去污剂, 发现用溴化十六烷基三甲铵进行分离, 脂类的残留量不足3%, 而用十二烷基磺酸钠分离残留量最高, 为14%~35%。用非离子型去污剂辛苯聚醇-8 (TRITON.RTM.X-114)分离时, 蛋白回收率可达85%~95%。Stalberg等^〔6〕利用TX-100进行分离, 蛋白回收率可达97%。

2.2.7 超临界气体提取法

该法的基本原理是在高压下二氧化碳液化, 将卵黄中的脂溶性物质溶解在其中, 并随气流带走。将卵黄粉末装入超临界气体抽提装置, 通入300 kg/cm², 40℃二氧化碳超临界气体与卵黄粉末混合, 在60 kg/cm², 40 ℃的减压条件下, 被抽提出的杂质与超临界气体分开而进入分离室, 即可得到去除脂类的卵黄粉末。将去脂的卵黄粉末溶于20倍磷酸盐缓冲液中, 搅拌, 离心, 即可得水溶性组分。

2.3 卵黄囊抗体的提取方法

提取的目的是将大量卵黄囊抗体从水溶液中分离出来, 得到卵黄抗体。目前主要通过超滤法或沉淀法来实现。沉淀法所用的沉淀剂包括无机物、有机物或有机溶剂, 也可以采用多种方法联合沉淀, 或者沉淀法和超滤法相结合的方法提取卵黄囊抗体。

2.3.1 超滤法

超滤法具有浓缩、除盐、分级和纯化作用。卵黄囊抗体的分子量约为180 kD, 在提取时可采用截流值为100 kD的超滤膜。研究表明, 在水稀释法分离后经硫酸钠沉淀, 超滤, 回收率为9.8 mg卵黄囊抗体/ml蛋黄, 纯度94%。超滤法具有所需设备较简单、操作方法简便等优点, 适合大规模工业化提取卵黄囊抗体。

2.3.2 无机物沉淀法

向含有卵黄囊抗体的水溶液中加入无机盐或无机盐过饱和溶液, 使卵黄囊抗体在高盐条件下盐析。常用的无机盐有硫酸钠和硫酸铵。Kritratanasak等^〔7〕利用硫酸铵盐析法成功获得较高纯度的抗鼠IgG卵黄抗体(I-gYanti-mouse IgG), 每个鸡蛋可收获约40 mg卵黄囊抗体。采用无机盐沉淀后所得固体, 一般需经半透膜透析以除去残留的盐分。Ko和Ahn^〔8〕比较了硫酸铵沉淀法及离子交换法, 结果发现, 前者所制备的卵黄囊抗体纯度高于后者, 而且适合于大量样品的制备。

2.3.3 有机物及有机溶剂沉淀法

Polson最初的PEG法采用终浓度为3.5%的PEG 6000对卵黄进行分离获得水溶性组分, 用12% PEG进行沉淀, 沉淀物经磷酸盐缓冲液溶解后再用12% PEG沉淀, 得到卵黄囊抗体。之后, Polson^〔9〕对此方法加以改进, 先后经12% PEG和-20℃的50%乙醇两步沉淀法获得卵黄囊抗体, 蛋黄回收率4.9 mg/ml, 纯度89%。卵黄囊抗体的提取一般采用联合沉淀法, 即利用不同的沉淀剂对水溶性组分经过2次或多次沉淀, 从而获得纯度较高的卵黄囊抗体。

2.4 卵黄囊抗体的纯化方法

为了满足不同的使用目的, 许多情况下需对提取的卵黄囊抗体进一步纯化, 除去其中的杂蛋白、盐或其他杂质, 获得高纯度的卵黄囊抗体。目前主要采用层析方法纯化卵黄囊抗体, 包括凝胶过滤层析、离子交换层析以及亲和层析等。

2.4.1 凝胶过滤层析

主要利用具有网状结构的凝胶分子筛作用, 可根据被分离物的分子大小不同选择不同的凝胶介质进行层析。卵黄囊抗体纯化时, 常用交联葡聚糖作为凝胶层析介质。研究人员对PEG法分离获得的卵黄抗体采用疏水层析(HIC)和凝胶过滤(GF)两步法纯化, 产物纯度较高。1 ml含58 mg卵黄抗体的稀释液, 经过PEG分离、HIC和GF处理后, 卵黄抗体含量依次为35, 4.7和1.2 mg。

2.4.2 离子交换层析

纯化卵黄囊抗体时多采用以葡聚糖交联的弱碱性阴离子交换剂DEAE为载体, 磷酸盐缓冲液作为吸附-洗脱体系进行分离纯化。用DEAE-Sephacel柱层析可获得纯度为98%卵黄囊抗体, 每个鸡蛋黄可收获70~100 mg卵黄囊抗体。

2.4.3 亲和层析

纯化卵黄囊抗体采用的亲和层析方法包括亲硫层析、固相金属离子亲和层析、合成配体亲和层析以及免疫亲和层析等。

2.4.4 方法应用比较

综上所述, 经过分离和提取方法通常就可以得到纯度较高的卵黄抗体。衡量一个制备方法的优劣要考虑分离、提取和纯化的全过程, 从工艺路线、工艺条件以及回收率和纯度等方面综合评价。从工艺路线上看, 水稀释法(WD法)、卡拉胶法(CAR法)、超临界气体提取法(SFE法)和硫酸铵法(AMS法)工艺路线较短, 而其他方法需两步或更多步骤获得沉淀; 工艺条件方面, AMS法需-20℃冷冻, SFE法需要超临界气体抽提设备, 对设备要求较高; 从原材料成本看, CAR法采用的是天然胶, 成本较高; 从回收率和纯度方面看, WD法和SF E法的产品纯度和回收率都较高。综合上述因素, 认为WD法和SFE法具有工艺简便、生产成本较低、产品纯度和回收率高等优点, 适合于大规模工业化生产。

3 卵黄囊抗体的应用

虽然卵黄囊抗体结构与哺乳动物的IgG有所不同, 但它和IgG一样, 具有极高的免疫活性; 又缺少与补体、Fc片断、类风湿因子、蛋白A、蛋白G等结合活性, 特异性较强, 同时具备理化性质稳定、制备方便等优点。目前, 它广泛地应用于疾病诊断、免疫治疗、畜禽疾病防治及食品保健等许多方面。大量文献报道, 以卵黄囊抗体为基础的免疫相关检测技术(如ELISA、RIA等)已广泛用于蛋白质、短肽等的浓度检测。

3.1 在疾病诊断、预防治疗中的应用

近年来, 卵黄囊抗体技术广泛应用于各种疾病的诊断及防治中。在免疫治疗方面, 主要用于消化道、呼吸道疾病的预防和治疗。Brunda等^〔10〕人成功地运用卵黄囊抗体对法医标本进行印度眼镜蛇蛇毒检测。Van Coillie等^〔11〕利用鸡卵黄抗体建立间接竞争性ELISA方法检测牛奶是否遭受污染。

3.2 在免疫相关检测方面的应用

Deog Yong Lee等^〔12〕用鸡卵黄囊抗重组猪白细胞介素6(rpIL-6)特异抗体建立定量检测猪白细胞介素6(IL-6)的ELISA方法。该方法具有快速敏感的优点, 可以检测出10 ng/ml水平上的IL-6。Sunwoo等^〔13〕利用制备的特异性鸡卵黄囊抗体检测大肠埃希菌O157 :H7型菌株。结果表明, 检测特异性和灵敏度均优于血清来源抗体。

3.3 在畜禽病防治上的应用

目前国内外广泛应用的卵黄囊抗体包括抗传染性法氏囊病、抗鸡新城疫、抗鸭病毒性肝炎、抗番鸭细小病毒、抗猪大肠埃希菌卵黄囊抗体等。此外, 卵黄囊抗体还被应用于一些疑似病和新发病的防治研究。

3.4 在家畜养殖中的应用

Yokoyama H等^〔14〕利用犊牛沙门菌疫苗免疫鸡, 免疫后收集鸡蛋制备高免卵黄抗体粉。将提取的抗体干粉溶解在牛乳中, 喂养犊牛。结果表明, 给予效价为1:1000和1:500的抗鼠沙门菌抗体的犊牛死亡率为33%, 1:250或 < 1:250的均为100%;给予效价为1:2500和1:5000的抗都柏林沙门菌抗体的死亡率分别为40%和0;对照组的死亡率为100%。随着卵黄抗体滴度的升高, 临床反应与抗体滴度呈现良好的量效关系。

3.5 存在问题

应用卵黄囊抗体防治疾病也有不可避免的缺点, 如可能带有蛋传性疾病的病原(如支原体等), 对畜禽养殖业存在潜在的威胁。卵黄囊抗体营养丰富, 在生产、储存、运输等过程中易受污染。目前, 卵黄囊抗体的生产制备还没有统一的质量标准, 没有规范的操作规程, 没有可用于监测的质量标准等。同时, 用于制备禽用抗体所选用的多为商品用禽类, 自身的抗体水平不一, 影响卵黄囊抗体的效价水平, 在生产中易对正常的免疫发生干扰作用。此外, 由于粘稠度较大, 直接注射困难、吸收慢, 在注射部位易形成干酪样物质、肿大或坏死等, 从而影响了抗体的使用。因此, 卵黄囊抗体产品质量有待于进一步提高, 产品性状有待改善。

4 展望

卵黄囊抗体技术替代传统的采血技术生产卵黄抗体, 不仅可获取高效的抗体, 而且对动物的应激也最小。自发现卵黄囊抗体以来, 众多的研究人员对卵黄囊抗体的结构、生理功能及应用作了广泛深入的研究, 取得了可喜的成绩, 尤其在免疫诊断、治疗、疾病防治等方面成果显著。欧美等国的多家企业已可以提供用于基础研究或临床诊疗的特异性卵黄囊抗体。国内, 大连赛姆生物工程技术公司的研究项目"IgY在疾病防治方面的应用"已完成中试及产品企业标准的制定。

综合比较上述制备及纯化方法, 笔者认为, 卵黄囊抗体生产工艺流程宜采用水稀释法初步分离以去除脂类杂质, 硫酸铵沉淀法、超滤法或超临界气体提取法分离, 最后利用亲和层析方法进一步纯化卵黄囊抗体, 可以获得高纯度的抗体, 同时会产生较高的回收率。该操作方法简便, 适于大规模工业化生产, 产品质量显著提高。可以预见, 随着动物免疫技术的推广、产品质量进一步提高以及相关动物保护法律法规的出台, 卵黄囊抗体技术必将获得更快的发展, 同时卵黄囊抗体具有稳定性高、极少甚至没有交叉反应等与血清抗体的比较优势, 必将更加广泛地应用于疾病预防与治疗、相关检测技术方法等各个领域, 并且会产生巨大的经济效益和社会效益。