侵袭和转移是恶性肿瘤的重要特征, 也是患者死亡的主要原因。人类对肿瘤转移机制的研究已经有一百多年历史, 随着对肿瘤转移基因调控多阶段、多因素、多步骤理论的不断完善, 对于这一复杂病理过程有了更深入的认识。发现并证实与肿瘤转移高度相关的基因成为当前肿瘤转移机制研究的热点, 因为这些基因及其产物可能成为肿瘤抗转移治疗新的靶点或观察患者预后的重要指标。Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被克隆出来的蛋白, 它们是一组相对分子质量大约为20~25 kD的三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate, GTP)结合蛋白, 具有GTP酶活性, 因此, 习惯被称为Rho GTP酶, Rho GTP酶在细胞骨架重组调控方面起重要作用^〔1〕。近年来研究发现, Rho GTP酶在多种恶性肿瘤中高表达, 并和肿瘤的发生、侵袭和转移密切相关。本文主要从肿瘤细胞形态改变, 细胞与胞外基质粘附以及细胞骨架重组等几个方面, 对Rho GTP酶作用于肿瘤侵袭转移的分子调控机制综述如下。

1 Rho GTP酶

到目前为止, Rho GTP酶超家族已发现约20个成员, 根据结构和功能不同, 大致分为5个亚家族, 包括:(1) Rho亚家族, 包括RhoA、RhoB和RhoC, 在序列上具有高度同源性, 并在多种细胞中高表达, 主要参与张力纤维形成和粘着斑复合体(focal adhesion complexs, FACs)组装; (2) Rac亚家族:包括Rac1、Rac2、Rac3和RhoG, 促进层状伪足和胞膜皱褶形成; (3) Cdc42亚家族, 包括Cdc42、TC10、TCL、Wrch1和chp/ Wrch2, 其中Cdc42促进丝状伪足形成:(4) Rnd亚家族:包括Rnd1、Rnd3/RhoE和Rnd2, 在细胞中组成性激活表达并具有不同的组织分布, 可拮抗Rho信号通路; (5) Rho BTB亚家族, 包括Rho BTB1和Rho BTB2, 具体功能尚不清楚。在所有Rho GTP酶超家族成员中, Cdc42、Rac1和RhoA是目前研究最多的Rho GTP酶。

Rho家族各成员在氨基酸序列上有50%~55%的同源性, 在靠近催化位点处都有1个能和GTP结合的功能区, 与催化GTP水解密切相关。Rho GTP酶同Ras超家族的其他成员一样, 羧基端通常具有共同结构域, 即由半胱氨酸残基, 脂族残基和其他氨基酸残基组成的末端, 是翻译后修饰的位点^〔2〕。Rho GTP酶的翻译后修饰与其质膜定位有关, 只有经翻译后修饰的Rho GTP酶才具有活性并能与细胞膜上适宜的脂质分子结合。在异戊烯基转移酶的作用下, 半胱氨酸的巯基和异戊二烯基团间共价形成硫醚键, 并在内切酶的作用下水解掉末端其余3个残基, 最后异戊二烯基化的半胱氨酸残基在甲基转移酶的作用下发生甲基化, 完成翻译后的修饰。Rho家族蛋白同Ras超家族的所有成员一样在活性型/GTP限制型和失活型/二磷酸鸟苷(guanosine diphosphate, GDP)限制型构象之间循环。调节这个循环过程的3类重要蛋白是: (1)鸟苷酸交换因子(guanine-nucleotide exchanging factors, GEFs), 催化GDP的释放和GTP的结合, 活化Rho GTP酶。不同的Rho GEF在结构上都具有相同的功能域, 包含1个DH (Dbl homology domain)区和1个PH (pleckstrin homologyv domain)区, 前者与Rho GTP酶结合并催化其构象改变, 后者通过和细胞膜上特定的脂质作用使GEF在膜上定位; (2) GTP酶活化蛋白(GT Pase activating protein, GAP), 作为负向调节因子加速Rho GTP酶的水解, 使Rho GTP酶由活性状态变为无活性状态; (3) GDP解离抑制因子(GDP dissociation inhibitor, GDI), 阻止GDP从Rho GTP酶上分离, 抑制Rho GTP酶活性。

Rho GTP酶是细胞内多条信号转导通路的关键分子, 作为分子开关在胞内信号转导中发挥桥梁作用。Rho GTP酶可参与对正常细胞增殖、分化、凋亡的调节, 并与肿瘤的发生和转移密切相关。实验研究发现, 在多种肿瘤中可见Rho GTP酶表达异常, 改变细胞内Rho GTP酶的表达水平可以直接影响肿瘤细胞侵袭和转移的过程。

2 Rho GTP酶与肿瘤的侵袭转移

肿瘤细胞在基质中的运动由4个循环往复的步骤组成, 即头部伪足的形成和延伸, 新粘附位点的建立, 胞体的收缩以及尾部的退缩, 通过不断重复的4个过程向前迁移^〔3〕。对这一过程精确调节的分子机制非常复杂, 涉及胞内多条信号转导通路。在多条信号级连反应通路中, Rho GTP酶尤其是RhoA、Rac1和Cdc42是关键的调控因子, 主要参与对细胞形态改变, 细胞与基质粘附及细胞骨架重组的调控, 调节肿瘤细胞的侵袭转移过程^〔4〕。

2.1 细胞形态改变

伪足形成和细胞形态改变是侵袭转移的起始步骤。Rac可诱导质膜突起形成片状样的层状伪足, 而Cdc42诱导指头样突起的丝状伪足形成。在高侵袭和转移性的肿瘤细胞, 还可见一种侵袭伪足形成, 由于与细胞外基质降解密切相关, 可能成为主要的伪足结构^〔5〕。层状伪足与周围基质形成粘附连接, 产生细胞向前运动的锚着位点; 丝状伪足有助于细胞对周围环境的适应及确定细胞迁移的方向。Wiskott-Aldrich综合征蛋白家族(Wiskott-Aldrich syndrome protein, WASP)是调节细胞迁移的关键分子, 包括神经组织来源WASP (neural Wiskott-Aldrich syndrome protein, N-WASP), WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP family verprolin-homologous protein1, WAVE1), WASP家族富含脯氨酸同源蛋白2(WASP family-verprolin-homologous protein2, WAVE2)等成员, 也是Rac和Cdc42下游的重要效应子, 在肿瘤细胞中高表达, Rac和Cdc42通过活化WASP家族成员诱导伪足形成和基质降解^〔6〕。Lorenz等^〔7〕首次使用荧光共振能量传感器区分活性状态和失活状态的N-WASP构象, 并模拟内源性N-WASP功能发现, N-WASP在迁移的肿瘤细胞头部层状伪足形成中起重要作用。细胞迁移头部高度动态性伪足结构的形成依赖肌动蛋白单体聚合和肌动蛋白纤维的延长, WASP家族不同成员通过不同的结构域与Rac和Cdc42结合而活化, 而肌动蛋白相关2/3复合体(actin-related 2/3 complexs, Arp2/ 3 complexs)和肌动蛋白单体通过分别结合于活化的WASP家族羧基端共同的结构域, 直接调控肌动蛋白单体聚合^〔8〕。Arp2/3复合体是肌动蛋白组装的核心, 可将肌动蛋白单体从头合成组装为肌动蛋白丝, 进而促进丝状伪足和层状伪足的形成^〔9〕。Arp2/3复合体与WASP的结合是调控肌动蛋白聚合的重要因素, 两者在多种肿瘤细胞中共表达, 对115例肺腺癌组织切片免疫组化染色发现, 78例(67.8%)共表达Arp2/3和WAVE2, 并与病人临床生存时间负相关; 多变量回归分析揭示, Arp2/3和WAVE2的共表达是肿瘤复发的独立危险因素^〔10〕。并且N-WASP和Arp2/3复合体也是高侵袭和转移性肿瘤细胞侵袭伪足形成的主要调节子, 并可能成为肿瘤治疗的重要靶位^〔11〕。肌动蛋白单体的聚合和伪足形成还依赖另一种关键调节子cofilin, cofilin可使肌动蛋白单体从肌动蛋白丝的顶端解离, 诱导肌动蛋白丝从头部折断, 产生新的末端。Rac和Cdc42可通过活化共同的底物p21激活激酶(p21-activated kinase, PAK), 分别激活LIM (3种同源异型结构域蛋白lin-11、isl-1和mec-3)激酶1(LIM kinase1, LIMK1)和LIM激酶2(LIM kinase2, LIMK2), 磷酸化cofilin使其失活而抑制肌动蛋白的解聚, 稳定肌动蛋白细胞骨架。

2.2 细胞-基质粘附

伪足形成启动细胞迁移的过程, 但细胞持续的迁移需依赖细胞伪足与细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的稳定粘附, 提供细胞向前迁移的牵引支点。迁移的细胞头部与ECM的粘附和尾部与ECM的去粘附的不断交替使得细胞向前迁移, Rho GTP酶对这一过程发挥精确的调节。细胞表面的整合素受体与ECM中特异的配体结合, 通过整合素聚集成簇而形成FACs, 而整合素受体的胞内区与桩蛋白(paxillin), 纽蛋白(vinculin)和踝蛋白(talin)等多种肌动蛋白结合蛋白相互作用形成分子桥, 并与细胞骨架相连, 提供细胞迁移的锚着位点。活化的Rac可诱导肌动蛋白的聚合和层状伪足的形成, 同时也能诱导新的FACs的形成, 而FACs的形成又能反过来活化Rac, 这一正反馈的失控可增加肿瘤细胞的侵袭能力^〔11〕。Jung^〔12〕发现, 活化的Rac1和Cdc42, 可通过激活PAKl磷酸化下游的粘着斑激酶(focal ad-hesion kinase, FAK), 活化的FAK作为分子支架招募胞浆中桩蛋白, 纽蛋白和踝蛋白等至FACs, 促进FACs的形成。p65激活激酶还可通过LIMK间接调节cofilin的活性, cofilin在活性型和失活型间的循环可调节肌动蛋白亚单位从肌动蛋白丝末端的解离和聚合, 并对促进肌动蛋白纤维组装时踏车(treadmilling)现象的发生非常必要^〔3〕。肿瘤细胞侵袭和转移与ECM的降解密切相关, Rho GTP酶可直接或间接调节下游效应子促进ECM的降解。对人乳腺癌细胞株MDA-MB-435的研究发现, Rac1和Cdc42可通过间接活化LIMKl上调丝氨酸蛋白酶尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase type plas-minogen activator, uPA)系统, 增加uPA启动子活性, 诱导uPA和uPA受体mRNA和蛋白表达及uPA的分泌, 降解ECM胶原等成分, 有助于细胞的侵袭转移^〔13〕。

2.3 细胞骨架重组

侵袭和转移的肿瘤细胞的持续运动需依靠张力纤维收缩和肌动蛋白丝的延长提供动力, Rho GTP酶可通过调节细胞骨架的重组, 为细胞迁移提供动力。张力纤维是真核细胞中一种稳定的、平行排列的微丝结构, 由肌动蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等组成, 肌动-肌球蛋白相对运动产生的收缩力是细胞迁移动力的主要来源。Rho及其下游的Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶(Rho associated coiled-coil forming protein kinase, ROCK)可提升肌球蛋白轻链(myosin light chain, MLC)的磷酸化水平, 增加肌动-肌球蛋白的收缩力促使细胞在ECM中的迁移。ROCK是Rho下游的重要效应分子, 包括Rho激酶和p160ROCK 2个成员。活化的ROCK通过2条通路提升MLC的磷酸化水平, 一方面ROCK磷酸化其底物肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phos-phatase, MLCP)的肌球蛋白结合亚单位(myosin-binding sub-unit, MBS)而抑制MLCP的磷酸酶活性, 减少MLC磷酸基团的水解; 另一方面, ROCK可直接磷酸化MLC, 增加MLC的磷酸化水平, 从而增加与肌动蛋白丝交联产生的收缩力。抑制Rho/Rock通路能抑制肿瘤细胞张力纤维的收缩和细胞侵袭, 显性激活(dominant active)的p160ROCK的质粒转染的人卵巢癌细胞具有更强的侵袭和迁移能力, 而用p160ROCK的反义寡核苷酸处理的癌细胞侵袭和迁移能力可显著减弱^〔4〕。Rho还可作用于下游另一重要效应分子mDia (Mammalian Di-aphanous-related protein)蛋白, 活化的mDia蛋白可将肌动蛋白单体参入到肌动蛋白丝的末端, 并阻止成帽蛋白的结合, 诱导肌动蛋白丝的延长, 有助于细胞迁移^〔15〕。

3 Rho GTP酶在肿瘤侵袭转移诊断和治疗中的意义

由于Rho GTP酶在许多恶性肿瘤中高表达, 因此, Rho GTP酶可能成为肿瘤转移的临床诊断指标。对53例胃癌病人和7名胃肿瘤细胞株的Rho超家族7名主要成员RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3和Cdc42 mRNA表达水平的检测发现, RhoA、Rac1和Cdc42在胃癌组织切片中的平均表达水平显著高于癌旁组织切片, RhoA的表达水平与肿瘤分期显著正相关并和组织分化程度负相关, RhoA和Rac1在7种胃肿瘤细胞株中的mRNA表达水平, 总蛋白量及活性都显著高于正常胃粘膜上皮细胞株^〔16〕。RhoC在许多恶性肿瘤中高表达, 特别是在转移性肿瘤中表达异常增高^〔17〕。在原发胃癌细胞中RhoC的表达显著高于正常胃上皮细胞, 在有淋巴结转移的原发胃癌中RhoC的表达显著高于没有淋巴结转移的原发癌, 在有多个淋巴结转移的原发胃癌中RhoC的表达也显著高于较少淋巴结转移的胃癌细胞, 穿过浆膜的胃癌细胞比在胃壁中的胃癌细胞具有更高的RhoC表达, 表明RhoC的过表达与肿瘤细胞的高度浸润相关, 提示RhoC可作为胃癌病人临床预后的重要指标。鉴于Rho GTP酶与肿瘤转移的相关性, 使其可能成为转移性肿瘤临床转移及预后分析的重要指标。

由于Rho GTP酶与肿瘤侵袭转移密切相关, Rho GTP酶及其下游靶分子可能成为抑制肿瘤转移的重要靶位。特异性的ROCK抑制剂Wf-536可在体内抑制小鼠Lewis肺癌转移及肿瘤细胞诱导的新生毛细血管生成, 并在体外抑制肿瘤细胞在基质胶上的侵袭和迁移^〔18〕。由于Rho GTP酶翻译后羧基端的修饰对于其正确的膜定位和活化非常重要, 因此多种异戊烯基转移酶抑制剂如Zarnestra, Sarasar, L-778等^〔2〕, 通过阻断Rho GTP酶C端翻译后修饰位点的蛋白质法呢基化, 已被证实在肿瘤治疗中有较好疗效, 而且针对某一种Rho GTP酶(如RhoA、RhoB、Rac1或Cdc42)的特异性异戊烯基转移酶抑制剂将具有更好的临床治疗效果^〔19〕。由于针对Rho GTP酶进行的肿瘤治疗能够减少传统抗癌药物的副作用, 因此, Rho GTP酶已成为肿瘤药物开发的新靶位, 对于肿瘤的临床治疗将具有良好的应用前景。