亚硝酸根广泛存在于环境、水体、食品和土壤中, 它与脂肪族和芳香族的胺类化合物反应生成的N-亚硝胺化合物一直是公认的强致癌物, 因此, 亚硝酸根是环境、水质、食品等检测的重要指标之一。检测亚硝酸根的方法有光度法^〔1〕、荧光法^〔2〕、电化学法^〔3〕、色谱法^〔4〕等。共振光散射是一种新分析技术, 多用于蛋白质、核酸等大分子的分析测定^〔5〕。目前, 基于重氮化-偶联反应共振散射光谱法测定亚硝酸根的报道较少。实验发现, 亚硝酸根-磺胺-N, N-二甲基苯胺重氮化-偶联反应体系的反应产物可产生强烈的共振光散射现象。我们对此现象进行研究, 建立了测定痕量亚硝酸根的新方法。

1 材料与方法 1.1 仪器和试剂

970 CRT荧光光度计(上海分析仪器总厂); 紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司); Nano-ZS90纳米粒度与Zeta电位分析仪(英国Malvern公司)。亚硝酸根标准溶液:用干燥的NaNO₂粉末配制含亚硝酸根为1 mg/ml贮备液, 临用时稀释为10 μg/ml; 磺胺溶液:5.8×10^-3mol/L (用乙醇溶解后再用水定容); N, N-二甲基苯胺溶液:0.015 mol/L (称取0.906 3 gN, N-二甲基苯胺, 加1.0 mol/L盐酸溶液25.0 ml, 待其溶解后用水稀释至500 ml); 乙酸钠溶液:4.0 mol/L, 水为16 MΩ的高纯水。所用试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

在2支25 ml比色管中, 依次加入磺胺溶液3.0 ml, 其中1支加入10 μg/ml的亚硝酸根溶液1.0 ml或适量样品, 另1支为试剂空白, 稀释到10 ml, 摇匀, 静置15 min, 加入0.015 mol/L的N, N-二甲基苯胺溶液3.0 ml, 4 mol/L的乙酸钠溶液1.4 ml, 定容至25 ml, 摇匀, 静置25 min。以试剂空白为参比, 在激发波长、发射波长均为533 nm的条件下, 测定溶液的共振散射光强度, 其中含亚硝酸根者为I, 试剂空白为I₀, 计算 I ( I=I-I₀)。

1.3 样品分析

取新鲜白菜、土豆样品洗净, 晾干。称取30 g样品在研钵中研碎, 加入60 ml蒸馏水于60℃水浴锅中浸泡10 min, 滤入100 ml容量瓶中, 定容。取白菜、土豆样各0.5 ml, 按实验方法进行测定, 样品中亚硝酸根的含量由式(1)计算得到。

(1)

式中:X-样品中亚硝酸根的含量(μg/g); C-由回归方程计算得到比色管中亚硝酸根的总含量(μg); V₁-浸取液的总体积; V₂-取样体积; W-样品的质量。

2 结果 2.1 光谱

以蒸馏水为参比, 测定磺胺-N, N-二甲基苯胺-亚硝酸根体系的吸收光谱(图 1)和共振散射光谱(图 2)。由图 1可知, 磺胺与亚硝酸根反应生成的重氮盐在可见光区无吸收, 在弱碱性介质中重氮盐与N, N-二甲基苯胺反应生成的偶联产物在370和500 nm处有吸收, 并且随着亚硝酸根量的增加其吸收逐渐增强。由图 2可知, 磺胺、N, N-二甲基苯胺及生成的重氮盐的共振散射光强度均为0, 与基线重合, 偶联反应的发生使得共振散射光明显增强, 在468和533 nm处产生2个共振散射峰, 533 nm处的共振散射光强度大且稳定, 其强度与亚硝酸根浓度呈正比, 因此, 实验选择533 nm作为定量测定波长。利用激光纳米粒度仪测得偶联反应产物的平均粒径为342 nm, 说明在反应条件下偶联反应产物发生聚集, 聚集产物具有较大的平均粒径从而使得共振散射光强度明显增强。

2.2 酸度的影响

按照实验方法改变盐酸的加入量。结果表明, 当盐酸的用量为0 ml时, 体系的共振散射光最强, 且稳定性、重现性良好。因此, 实验过程中不直接加入盐酸, 体系的酸性环境由N, N-二甲基苯胺溶液中的酸提供。

2.3 乙酸钠用量的影响

按照实验方法改变乙酸钠的加入量。结果表明, 乙酸钠用量为1.4 ml时体系的共振散射光强度有最大值, 故选用乙酸钠用量为1.4 ml。

2.4 磺胺用量的影响

按照实验方法改变磺胺的加入量。结果表明, 磺胺的用量为3.0 ml时体系的共振散射光强度较大且重现性好。因此, 实验选用磺胺的加入量为3.0 ml。

2.5 偶联试剂N, N-二甲基苯胺用量的影响

按照实验方法改变N, N-二甲基苯胺的加入量。结果表明, N, N-二甲基苯胺用量在3.0 ml时体系的共振散射光强度最大且稳定, 本实验选用N, N-二甲基苯胺的用量为3.0 ml。

2.6 重氮化反应时间的影响

按实验方法改变重氮化反应时间进行测定。结果表明, 重氮化反应时间为15 min时共振散射光强度最大。本实验选择重氮化的反应时间为15 min。

2.7 偶联产物的稳定性

实验发现, 偶联产物的共振散射光强度在10 min内达到稳定并在70 min之内保持不变, 在24 h之内基本不变, 即产物的共振散射光强度稳定。实验选择静置时间为25 min。

2.8 工作曲线的绘制

按照实验方法改变亚硝酸根的加入量, 测其共振散射光强度。结果表明, 10 μg/ml亚硝酸根的加入量在0~3.0 ml (0~1.2×10^-3g/L)时, 线性关系良好。用最小二乘法进行回归, 求得回归方程为:

回归系数为:R=0.998 3, 按12次空白实验的标准偏差的3倍除以工作曲线的斜率, 得到方法的检出限为8.0×10^-5g/L。

2.9 共存离子的影响

按照实验方法, 当亚硝酸根含量为10μg/25 ml, 相对误差≤±10%时, 对23种常见离子进行了干扰实验。实验发现, 各种离子允许共存的倍数为K⁺, Ca²⁺, NO₃^-, Mg²⁺, Ba²⁺, Br^-, SO₄^2- 500倍; Sn²⁺, F^-, PO₄^3- 200倍; Ni²⁺、Se²⁺ 100倍; Ge⁴⁺ 20倍; Cu²⁺, Fe²⁺, I^-, S₂O₃^2- 10倍; Zn²⁺, Ag⁺, Co²⁺, A1³⁺, Hg²⁺, Mn²⁺ 5倍。0.1 mol/L的酒石酸钠1.0 ml, 可掩蔽100倍的Co²⁺, 50倍的Hg²⁺和Mn²⁺, 20倍的Cu²⁺; 0.1 mol/L的柠檬酸三钠1.0 ml, 可使Zn²⁺允许共存的倍数提高到100倍。

2.10 样品分析结果

对白菜、土豆样品进行测定, 测得白菜、土豆样中亚硝酸根的含量分别为36.7和7.3 μg/g, 加标回收实验测得回收率为98.5%和92.8%。

3 小结

该方法简单, 灵敏度高, 选择性好, 可用于蔬菜中亚硝酸根含量的测定, 回收率为92.8%~98.5%。