环孢素A (cyclosporin A, CsA)是目前器官移植术后广泛使用的免疫抑制剂, 但肾毒性是限制其临床应用的主要副作用。拮抗CsA引起的肾间质纤维化, 是器官移植后保障患者长期存活的重要措施之一。慢性肾毒性机制目前尚不十分清楚, 有报道认为, 与肾素-血管紧张素系统(renin -angiotensin system, RAS)密切相关^〔1〕。本研究采用口服剂型CsA慢性肾毒模型, 观察慢性肾毒性时肾脏功能、RAS及病理的变化, 探讨慢性肾毒性的发生机制, 并应用丹参为干预措施, 观察其对CsA慢性肾毒性的保护作用。

雄性SD大鼠30只, 体重220~280 g (河南省实验动物中心)。

CsA口服液(瑞士诺华公司), 含CsA 100 mg/ ml。使用前用橄榄油稀释, 使CsA浓度为25 g/ L; 复方丹参注射液(四川升和制药公司), 含丹参2 g/ ml。

采用随机区组设计将动物随机分为对照组、模型组及丹参组, 每组10只。对照组为橄榄油(CsA溶剂); 模型组为CsA和葡萄糖; 丹参组为CsA加复方丹参注射液。按实验设计, 控制室温为20~25 ℃, 3组大鼠给予低盐饮食1周, 收集24 h尿液, 记录尿量, 然后断尾采血。此后在灌服橄榄油或CsA前30 min, 对照组和模型组大鼠每天经腹腔注射5%葡萄糖注射液4 ml/ (kg·d); 丹参组大鼠每天注射复方丹参注射液4 ml/ (kg·d)。然后对照组大鼠每天灌服橄榄油1.2 ml/ (kg·d); 模型组、丹参组大鼠每天分别灌服CsA 1.2 ml/ (kg·d)。观察期间大鼠自由进食进水, 各组大鼠每7 d称体重1次, 调整CsA、橄榄油及丹参用量。灌药后第28 d, 各组动物分别再入代谢笼收集24 h尿液, 记录尿量, 断尾采血。血标本用于检测血肌酐和钠; 尿标本用于检测尿肌酐、钠及N -乙酰-β-D -氨基葡萄糖苷酶(NAG)。第29 d动物在乙醚麻醉下, 经大鼠内眦采血3 ml, 迅速注入放在冰水溶液中冷却的酶抑制剂抗凝管中摇匀, 4 ℃下1 000 r/ min离心5 min, 分离血浆, 放入冰箱-20 ℃保存。待标本收集齐后, 同时检测血浆肾素(PRA)、血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)及醛固酮(ALD)的含量。然后在严格的无菌条件下开腹, 取左肾标本固定于40 g/ L多聚甲醛液中, 用于常规病理检查。

血、尿标本肌酐(Cr)测定采用去蛋白终点法, 钠的测定采用火焰光度法, 按标准公式计算内生肌酐清除率(Ccr)及滤过钠排泄分数(FE_Na); NAG测定采用对硝基酚比色法, 结果以酶单位与同一样品尿肌酐比值表示(U/ g Cr)。肾素活性、血管紧张素Ⅱ及醛固酮的放射免疫分析按试剂盒(北京北方生物技术研究所)说明书操作。放射性测量使用SN -682型γ计数器(上海核福光电仪器有限公司)。

常规石蜡切片, 苏木素-伊红(HE)染色。应用MPIAS -500多媒体彩色病理图文分析系统(同济医科大学清平影像工程公司研制), 在100倍视野下观察、测量。病理观察及半定量评分标准参照有关报道^{〔2, 3〕}, 观察20个以上高倍视野。肾小管损伤标准:细胞空泡变性, 肾小管塌陷(与间质纤维化和肾小管膜增厚无关)及肾小管肿胀; 肾间质损伤标准:单个核细胞浸润, 间质细胞空泡变性, 水肿及间质纤维化、瘢痕化; 肾小球小动脉病变:观察并计算100个肾小球, 计数入球小动脉受损伤的百分比, 其病变病理特征为入球小动脉的玻璃样变或肌性增厚。标准:0为正常; 0.5为 < 5%组织损伤; 1为5%~20%损伤; 115为21%~35%损伤; 2为36%~50%损伤; 215为51%~65%损伤; 3为> 65%损伤。

各组间的比较采用方差分析, 进一步两两比较用Student -Newman -keuls方法。

表 1

表 1 各组大鼠用药前和用药后尿量及Ccr比较(x±s)

表 1 各组大鼠用药前和用药后尿量及Ccr比较(x±s)

表 2

表 2 各组大鼠用药前和用药后FENa及NAG比较(x±s)

表 2 各组大鼠用药前和用药后FENa及NAG比较(x±s)

表 3

表 3 各组大鼠用药第29 d后血浆肾素、血管紧张素Ⅱ、ALD浓度(x±s)

表 3 各组大鼠用药第29 d后血浆肾素、血管紧张素Ⅱ、ALD浓度(x±s)

表 4

表 4 各组大鼠肾病理组织学半定量评分比较(x±s)

表 4 各组大鼠肾病理组织学半定量评分比较(x±s)

对照组大鼠仅有轻度肾小管上皮细胞浊肿及间质纤维化改变; 模型组大鼠均有明显不同程度的病理改变, 表现为肾小管上皮细胞浊肿及空泡变性, 小管塌陷及小管肿胀; 间质可见有局灶性分布的条状纤维化, 单核细胞浸润及间质扩增, 入球小动脉玻璃样变。与对照组比较差异均有统计学意义(P < 0.01);丹参组上述病变明显减轻, 与模型组比较肾小管病变差异有统计学意义(P < 0.01), 间质及小动脉病变差异有统计学意义(P < 0.05)。

CsA的慢性肾毒性的机制至今仍不清楚, Lee等^〔4〕提出RAS系统在疾病的发病中占有重要作用。实验证明, 长期输注Ang Ⅱ可引起明显的肾间质细胞增生和纤维化^〔5〕。应用血管紧张素转换酶抑制剂及Ang Ⅱ受体阻滞剂均能部分阻止CsA诱导的肾内血管收缩^〔6-8〕, 缓解肾毒性作用的发生。本研究发现, CsA能诱导肾小球滤过率下降, 增加尿中NAG的排泄; 使血浆PRA、Ang Ⅱ水平升高; 肾间质纤维化和小动脉病变等, 表明CsA能激活RAS系统, AngII水平的升高可诱导肾血管收缩, 引起肾缺血性损伤, 导致肾间质纤维化, 提示RAS的激活特别是Ang Ⅱ的上调, 参与了CsA诱导的肾毒性作用。

尽早干预RAS成为防治CsA肾毒性的重要策略之一。本研究将丹参预防性地应用于CsA慢性肾毒模型中, 发现丹参对激活的RAS系统有抑制作用, 同时丹参能提高肾小球滤过率改善肾功能, 减轻肾小管空泡变性及间质纤维化等病理改变, 表明丹参对CsA慢性肾毒性有很好的保护作用。其保护的机制可能是通过多种途径: (1)降低RAS系统的活性, 减轻肾血管收缩, 改善肾缺血性损伤, 减轻肾间质纤维化; (2)丹参是传统的活血化淤中药, 可降低红细胞压积及全血或血浆粘稠度, 扩张小血管, 改善肾皮质毛细血管的血流动力学^〔9〕; (3)有抑制成纤维细胞增殖并促其凋亡的作用^〔10〕, 从而减轻CsA引起的慢性肾间质纤维化。

本研究各组之间血浆醛固酮水平差异无统计学意义(P > 0.05), 尽管CsA对RAS有明显的刺激作用, 但血浆醛固酮的分泌并不受影响, 可能与CsA诱导肾上腺选择性地抵抗Ang Ⅱ的作用有关^〔4〕。