D-半乳糖衰老机制是指在一定时间内, 给动物连续注射大剂量的D-半乳糖, 使机体细胞内半乳糖浓度增高。在醛糖还原酶的催化下, 还原成半乳糖, 此物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内, 影响细胞的正常生理代谢, 导致机体衰老^〔1〕。角黄素是一种酮基类胡萝卜素, 主要以全反式异构体形式存在于自然界的海洋动物体、藻体及少数陆生植物体内并具有多种生物学功能, 其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出^〔2〕。本实验旨在通过角黄素对D -半乳糖诱导大鼠衰老模型各脏器丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化酶(GSH -Px)活性进行测定, 并与模型组进行比较研究此类化合物对D-半乳糖致衰老大鼠抗氧化能力的影响。

Labconco 冰冻真空干燥仪(法国乐高公司); 752分光光度计、AE 100电子天平(中国伯乐公司); 电热三用水箱、KA-1000型台式离心机(中国杭州华亭公司); 960型荧光分光光度计、J2 -SH高速冰冻离心机(日本岛津公司); C30柱(YMC Caro tenoid S-5, Waters), 高效液相色谱(HPLC) (Waters 600E溶剂输送系统, PDA-2996二极管阵列检测器Waters), MDA、SOD 和GSH-Px 测定试剂盒(南京建成生物工程研究所); 角黄素乳化剂(瑞士罗氏公司); 乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE) (美国迪马公司); 无水乙醇(北京化学试剂公司); 大孔吸附树脂(天津农业股份公司)。

称取10 g乳化颗粒加入300 ml丙酮-正己烷萃取。静置2 h后, 将脂溶性相收集后进行提取液浓缩处理。

(1)装柱:将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中, 用正己烷润湿。(2)洗脱:分别取2 ml角黄素提取液上柱, 用50 ml正己烷-丙酮淋洗, 收集洗脱液, 用氮气吹干制粉。

根据其HPLC中保留时间和紫外可见吸收光谱的特征峰与标准品对照进行鉴定。

6周龄Wistar雄性大鼠75只随机分为5组, 即致衰老模型组、青年对照组和角黄素组(低、中、高剂量组每天每只分别以0.2 ml灌喂10, 15, 20 mg/ (kg·bw), 每组15只。另购16月龄同品系大鼠15只作为正常老年对照组。致衰老模型组和各剂量角黄素组每天用1.5 g/ (kg·bw)的D-半乳糖颈背部皮下注射, 剂量为0.1 ml/ 10g。青年对照组注射等量的生理盐水, 每天1次, 连续注射5个月, 自由进食进水。实验结束时称量鼠的体重并取各组人鼠, 称重后乙醚麻醉, 暴露腹部, 下腔静脉取血, 待测血清MDA含量, 血中SOD和GSH-Px活性; 分离各组大鼠的肝脏、肾脏、心脏、脑和前列腺等脏器, 测定各脏器匀浆MDA含量和SOD、GSH-Px酶活性。

MDA含量测定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法; SOD活性测定采用亚硝酸盐法; GSH-Px活性测定采用5, 5-双硫代对硝基苯甲酸(DTNB)显色法。

采用SPSS 11.0软件进行齐性检验并作方差分析。

有机试剂的反复提取后, 通过柱层析法脱后可以得到高纯度的角黄素提取物, 经HPLC及其光谱特征峰鉴定为顺/反角黄素单体混合物。

表 1

表 1 血清MDA含量和血液SOD和GSH-Px活性(x ± s, n=15)

表 1 血清MDA含量和血液SOD和GSH-Px活性(x ± s, n=15)

与青年对照比较, 致衰老模型组血清MDA含量升高, 而血液SOD和GSH-Px活性均有所降低, 差异有统计学意义(P < 0.01), 与正常老龄对照组变化趋势一致, 说明D-半乳糖大鼠衰老模型成功建立。

表 2

表 2 不同脏器组织中MDA含量( x ± s, n=15, nmol/ ml)

表 2 不同脏器组织中MDA含量( x ± s, n=15, nmol/ ml)

实验表明, 不同剂量的角黄素明显降低大鼠各脏器组织MDA的含量, 与正常老龄对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。同时角黄素低、中、高剂量组的MDA含量随浓度呈下降趋势。

表 3

表 3 不同脏器组织中SOD酶活性( x ± s, n=15)

表 3 不同脏器组织中SOD酶活性( x ± s, n=15)

实验表明, 不同剂量的角黄素均能明显升高大鼠各脏器组织SOD酶活性, 与正常老龄对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。同时角黄素低、中、高剂量组的SOD酶活性随浓度呈上升趋势。

表 4

表 4 不同脏器组织中GSH-Px酶活性(x ± s, n=15)

表 4 不同脏器组织中GSH-Px酶活性(x ± s, n=15)

实验表明, 不同剂量的角黄素均能明显升高大鼠各脏器组织GSH-Px酶活性, 与正常老龄对照组比较差异有统计学意义(P < 0.01)。同时角黄素低、中、高剂量组的GSH-Px酶活性随浓度呈上升趋势。

本实验结果表明, 实验20周末, D-半乳糖致衰老模型组血清、肝脏中MDA含量升高, 而血液中SOD和GSH-Px活性降低, 同时致衰老模型组各项生化指标趋向正常老龄对照组, 说明D-半乳糖衰老模型建立成功。实验结果表明, 与D-半乳糖致衰老模型组比较, 角黄素各剂量组大鼠各脏器组织中MDA含量均明显减少, 说明角黄素可以抑制D-半乳糖衰老模型大鼠MDA含量的升高。而角黄素各剂量组大鼠各脏器组织中SOD和GSH-Px活性均明显增强。由此可推断角黄素可以抑制D-半乳糖衰老模型大鼠SOD和GSH-Px活性的降低。综上所述, 摄入适量的角黄素可以有效地改善D-半乳糖致衰老大鼠的抗氧化能力, 从而达到延缓衰老的作用。