丹参是我国防治心脑血管病的传统药物, 对冠心病、高血压、糖尿病肾病及癌症等疗效确切。近20多年来的药效研究表明, 丹酚酸是丹参活血化瘀作用的主要功能成分^〔1〕。自由基参与机体多种疾病的发生和发展过程, 清除自由基、提高机体抗氧化能力, 是许多药物防治慢性疾病的重要途径^{〔2, 3〕}。从化学结构上分析, 丹酚酸类化合物是酚羟基的供体, 具有抗氧化活性的结构基础。本文研究了丹酚酸对二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)的清除效应, 并探讨其对体外DNA氧化损伤的保护作用及可能机制, 为进一步研究丹酚酸药理作用提供科学依据。

LC-10A高效液相色谱仪(日本岛津公司); DU600紫外-可见分光光度计(美国Backman公司); Orion Ⅱ高灵敏度板式化学发光检测仪(德国Berthold Detection Systems公司)。Alltima C₁₈(150 mm × 4.6 mm, 5 μm)色谱柱; 流动相为水(0.5%冰醋酸) (A) -乙腈(B); 梯度条件: 0~30 min时5%~25% β, 30~60min时25%~30%B; 流速1.0ml/ min; 柱温为室温; 检测波长280 nm; 进样量20 μl。

丹酚酸B对照品(中国药品生物制品检定所, 批号111562-200403);二苯代苦味酰肼自由基(DPPH)、DNA、维生素C (VC) (美国Sigma公司); 二丁基羟基甲苯(BHT) (上海凌峰化学试剂有限公司); 实验用水为超纯水(18.2 MΩ), 其余试剂为分析纯。不同含量和组成的丹酚酸水提取物(AE)、乙酸乙酯萃取物(EE)、大孔吸附树脂纯化物(RE) (本实验室自制)。

参照文献〔4〕。反应体积为3 ml, 取0.5 m1不同浓度的样品加入6×10^-5 mol/ L的DPPH乙醇溶液中, 混匀后室温下测定DPPH反应液在517 nm处的吸光度。BHT、VC作对照比较。样品对DPPH的清除率(%)=〔A₀-A_样) / A₀〕 × 100%。A₀为DPPH对照在时间t=0时的吸光度值, A_样为加有样品的DPPH t=30 min时的吸光度值。

参照文献〔5〕。采用邻菲罗啉(Phen) -CuSO₄-VC-DNA体系检测清除羟自由基及对DNA损伤的保护作用。用0.1 mol/ L醋酸盐缓冲液(pH5.5)配制Phen -CuSO₄-VC-DNA溶液, 使Phen、Cu²⁺、VC和DNA的最终浓度分别为3.5×10^-3mol/ L、1.5×10^-4 mol/ L, 2.8×10^-3 mol/ L、150 μg/ ml。加入一定量的样品(对照用缓冲液补齐)。取该溶液1 ml, 放入发光仪样品池中, 加入200 μl 30%的H₂O₂溶液, 混匀, 启动发光反应, 连续测定发光强度(CL)。发光强度抑制率(%)=〔(CL_对照-CL_样品) / CL_对照〕 × 100。

在本实验条件下, DPPH浓度在5~60 μmol/ L范围内与517 nm下的吸光度有良好线性关系, $\text{Y}=0.010\ 4\text{X}+0.005\ 1$(R²=0.999 9)。不同的丹酚酸在各浓度下对DPPH自由基均有清除作用, 其清除能力与浓度在一定范围内呈量效关系。AE、EE、RE、VC、BHT对DPPH自由基的半数清除浓度(IC₅₀)分别为141.2, 15.3, 14.6, 15.8, 71.5 μg/ ml。其中, 丹酚酸EE、RE和丹酚酸B在5~25 μg / ml范围内随着浓度的增大, 清除DPPH能力呈线性增加。当样品浓度进一步增大到50 μg/ ml后, 其清除能力增加趋于平稳, 清除反应的量效关系与VC相似。在5~200 μg/ ml浓度范围内, AE清除DPPH的浓度效应呈线性关系, 浓度为200 μg/ ml时, AE清除DPPH的能力达到71.0%, 接近于同浓度下BHT的水平。实验观察了不同样品在浓度为25 μg/ ml时对DPPH自由清除能力的动力学变化(30 min)。AE、EE、RE在30 min内吸收值均不断下降, 超过30 min后仍有下降趋势。而对照AsA在反应启动后, 能快速清除DPPH自由基(6×10^-5 mol/ L), 并达到平衡。

Phen-CuSO₄-VC-H₂O₂-DNA化学发光体系中, Phen在金属离子的催化下与H₂O₂作用, 生成羟自由基, 产生最大发射在445~450 nm范围内的化学发光。羟自由基引起DNA损伤, 能产生一延迟于Phen本身氧化发光信号的慢化学发光。最大发光波长范围在380~420 nm。丹酚酸混合物AE、EE和RE均能有效防止羟自由基引起的DNA损伤。当AE终浓度分别为200, 500, 1 000, 2 000 μg/ ml时, DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为180, 240, 400, 1 220 s; 发光抑制率分别为13.74%, 26.64%, 46.50%, 68.93%。EE终浓度为25, 50, 160, 200, 400 μg / ml时, DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为320, 420, 520, 940, 1 980 s; 发光抑制率分别为27.13%, 56.17%, 71.52%, 76.96%, 90.67%。RE终浓度为25, 50, 100, 150, 200 μg / ml时, DNA损伤产物发光峰延迟时间分别为340, 400, 800, 960, 1 040 s; 发光抑制率分别为38.24%, 48.63%, 63.26%, 76.49%。丹酚酸的加入能使DNA损伤产物发光峰较空白对照组有明显下降, 且有明显后移现象, 浓度越大, 作用越强。AE、EE、RE的抑制发光50%的浓度(IC₅₀)分别为1293.6, 62.0, 49.2 μg/ ml。浓度为200 μg/ ml时, 丹酚酸AE、EE、RE的延迟时间大小顺序为RE> EE> AE。可见, 丹酚酸对DNA氧化损伤的保护能力大小依次为RE> EE> AE。

外标法测丹酚酸B标准品在不同浓度下所得的峰面积, 以浓度和对应峰面积建立线性回归方程, $\text{Y}=15\ 197\text{X}+92\ 80.2$(r²=0.999 8)。测得丹酚酸样品AE、EE、RE中丹酚酸B的纯度分别为5.6%, 74.4%, 90.5%。AE、EE、RE中除丹酚酸B (保留时间为28.465±0.10 min)外, 还存在5个共有峰, 保留时间(min)分别为20.748±0.05; 22.498±0.06, 24.032±0.07, 25.265±0.08, 32.698±0.20。分析各峰面积可知(AE、EE、RE浓度均为2 mg / ml), AE各峰面积均明显低于EE、RE, 显示AE中总丹酚酸含量低于EE和RE。RE中峰2, 3, 6的面积分别是EE的1.12, 6.55, 3.87倍, 而峰4, 5的面积则低于EE, 分别为EE峰面积的69%~40%。

丹酚酸对DPPH清除能力测定结果显示, EE、RE在各浓度下的清除率均明显高于AE, 同时EE、RE与丹酚酸B标准品(纯度是99.3%)相比较, 相同浓度(25μg/ ml)下, EE、RE对DPPH的清除率分别为78.97%和81.94%, 丹酚酸B的清除率为82.59%。可见, 丹酚酸B的纯度越高, 其清除能力越强。在Phen-CuSO₄ -VC-H₂O₂-DNA化学发光体系中, 与DPPH自由基清除能力相似, 对DNA氧化损伤的保护能力大小依次为EE> RE > AE。可见, AE的抗氧化能力明显低于EE和RE, 这与AE中的总酚含量低于EE和RE相一致。

相关性分析显示显示, 在DPPH反应体系中, 丹酚酸B含量低于13 μg时, 其含量与DPPH自由基清除能力之间有明显相关性(R²=0.898 4), 含量进一步增大后, 清除能力增加缓慢。原因可能是此反应浓度下的丹酚酸B能基本清除反应中的DPPH (6 ×10^-5mmol/ L)。在化学发光反应体系中, 丹酚酸B的含量与发光抑制率间的关系也有明显的相关性(R²=0.812 1)。由此推测, 丹酚酸B可能是样品中主要抗氧化物质。

本实验表明, 丹酚酸能有效清除DPPH自由基, 对羟自由基致DNA损伤具有明显的保护作用, 并存在一定的剂量效应关系, 是一种有效的天然自由基清除剂。酚酸类化合物具有清除自由基的结构^{〔6, 7〕}, 不同组成的丹酚酸, 由于各单体间结构的差异引起其清除自由基能力的不同。其中丹酚酸B是由三分子丹参素与一分子咖啡酸缩合合成, 结构上含有多个游离酚羟基。因此, 具有很强的提供氢质子的能力。从而阻断自由基链式反应, 并能通过清除体系中产生的羟自由基消除对DNA的破坏作用。张健等􀀁8􀀁把自由基清除剂对DNA损伤的保护机制分为3种:①延迟DNA损伤, 代表断链性作用; ②抑制DNA损伤, 代表预防性作用; ③延迟兼抑制DNA损伤, 代表断链兼预防性作用。不同组分的丹酚酸均可有效地清除羟自由基, 降低DNA损伤程度且延迟DNA损伤发生的时间, 表现出了丹酚酸具有断链兼预防性作用。

本次研究重点观察了丹酚酸在体外2种自由基反应模型中的作用, 表明其清除DPPH自由基能力及对DNA损伤的保护作用和丹酚酸B含量有一定相关性。丹酚酸组分表现出的抗氧化能力可能并不仅仅由于丹酚酸B的直接作用, 而存在其他丹酚酸类单体提供的作用和相互影响, 具体影响程度和原因有待于对未知丹酚酸峰作深入分析而确认。