Ⅰ型胶原是骨组织中唯一的胶原，由2条α₁链和1条α₂链组成，分别由iv型胶原α₁链(COL1A1)和iv型胶原α₂链(COL1A2)基因编码。iv型胶原基因的多态性多种多样，其基因的突变可导致很多疾病。近年来对它的研究主要集中在先天遗传疾病上^〔1〕。随着环境基因组计划(EGP)启动，越来越多的研究表明，骨组织的损伤反应不仅与暴露于环境有害因素的程度有关，同时还与遗传易感性或耐受性有着密切联系12-42。而有关COL1A2基因多态性的分布及其与氟斑牙发生发展关系报道较少。本次研究通过环境流行病学调查，采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法，分析iv型胶原α₂链(COL1A2) PvuⅡ各基因型在地氟病区(单纯高氟区、高氟高碘区)儿童中的分布，探讨该位点基因多态性与儿童氟斑牙的关系，为地氟病防治提供基础资料。

根据水氟和水碘监测资料，选择通许县某村作为单纯高氟区，平均水氟浓度1.8 mg/L，平均水碘浓度91.8 μg/L；选择开封县某村作为高氟高碘区，平均水氟浓度3.1mg/L，平均水碘浓度291.3 μg/L；另选择自然状况、经济条件、人口构成、农作物种类、生活习惯等条件均与高氟区相似，平均水氟浓度 < 1.0 mg/L，平均水碘浓度63.7 μg/L的通许县坡于村作为对照区。选择在当地居住5年以上8~12岁汉族儿童作为研究对象，经体检排除肝、肾功能异常、遗传疾病患者及接受钙剂、氟化物、激素替代治疗者；其中氟碘正常区60名，单纯高氟区74名，高氟高碘地区73名。

分别进行儿童氟斑牙检查，根据知情同意的原则，抽取外周血进行基因多态性分析。由口腔科执业医师和地氟病防治公共卫生执业医师按照Dean's级分类法诊断氟斑牙^〔5〕。以氟斑牙患病率(dental fluorosis，DF)和氟斑牙指数(community fluorosis index，CFI)为统计指标。

氟斑牙患病率(DF%)=(轻度及极轻度以上氟斑牙人数/受检查人数) × 100%

氟斑牙指数(CFI)=〔(可疑人数× 0.5) +(极轻人数× 1) +(轻度人数× 2) +(中度人数× 3) +(重度人数× 4)〕/受检查人数

全血基因组DNA提取试剂盒(Axygen Biosciences公司)；Taq DNA聚合酶、三磷酸脱氧核苷(dNTP) Mixtur℃(日本TaKaRa公司)；限制性内切酶PvuⅡ (立陶宛，MBI)；引物序列由上海生物工程公司合成。

COL1A2序列从GeneBank上检索得到，PCR扩增片段长度为584 bp，上游引物为: 5'-GGAAATATCGGCCCCGCTGGAAA-3'，下游引物为: 5'-GTCCAGGGAATCCAATGTTGCCA-3'。PCR扩增反应体系为50 μl，含模板DNA 6.0 μl、10 × buffer 5.0 μl、10 pmol/L的上下游引物、50 μmol/L的dNTP、2.0 mmol/L的MgCl₂和Taq酶2.5 U。扩增条件为: 94℃预变性5 min，94℃ 50 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，循环5次。然后94℃ 50 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s，循环25次，72℃末端延伸7 min。PCR产物经限制性内切酶PvuⅡ在37℃下水浴6 h，PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳。以PvuⅡ内切酶的第一个字母做标记，可分为3种基因型: PP、Pp和pp，其中p表示被切开，P表示未被切开。

采用SPSS 12.0统计软件进行四格表及列联表资料的χ²检验，以α=0.05为检验水准。

图 1

M:DL 2000 Marker；4:为阴性对照；1，2，3，5，6，7:PCR阳性产物 图 1 PCR扩增产物

图 2

M:100 bp DNA ladder；p:被切开；P:未被切开 图 2 COL1A2 PvuⅡ酶切结果

表 1

表 1 不同地区儿童COL1A2 PvuⅡ基因型的分布

表 1 不同地区儿童COL1A2 PvuⅡ基因型的分布

由表 1可见，3个地区儿童COL1A2 PvuⅡ 3种基因型之间的分布差异无统计学意义(χ²=5.191，P > 0.05)。

男性儿童3种基因型的分布频率分别为PP14.0%，Pp44.9%，pp41.1%；女性儿童的分布频率分别为PP16.5%，Pp35.0%，pp48.5%，各基因型在不同性别中分布差异无统计学意义(χ²=2.036，P > 0.05)

表 2

表 2 不同地区儿童氟斑牙患病率及氟斑牙指数比较

表 2 不同地区儿童氟斑牙患病率及氟斑牙指数比较

3个地区氟斑牙患病率差异有统计学意义(χ²=49.081，P < 0.05)，且2个高氟区的氟斑牙指数明显高于正常地区。进一步对单纯高氟区和高氟高碘区做四格表χ²检验，χ²=0.060，P=0.807 > 0.05，结果表明，单纯高氟区和高氟高碘区的氟斑牙患病率差异无统计学意义。

氟斑牙儿童3种基因型的分布频率分别为PP18.7%，Pp32.0%，pp49.3%；非氟斑牙儿童3种基因型的分布频率分别为PP13.2%，Pp45.0%，pp41.9%，氟斑牙和非氟斑牙儿童各基因型的分布差异无统计学意义(χ²=3.516，P > 0.05)。

本研究结果显示，3个地区儿童COL1A2 PvuⅡ酶切位点各基因型的分布频率与氟病区成年人该位点基因型分布频率相似^〔6〕，同时与Suuriniemi等^〔7〕对芬兰未成年女孩和Lau^〔8〕对中国香港老年人研究的基因型分布频率相同。比较各基因型在不同性别儿童中的分布频率，差异也无统计学意义。以上结果表明，COL1A2 PvuⅡ基因型在不同地区、不同性别人群中分布比较稳定，以突变型为主。

本研究结果显示，3个地区儿童COL1A2 PvuⅡ各基因型分布频率差异无统计学意义，但儿童的氟斑牙患病率差异有统计学意义；氟斑牙和非氟斑牙儿童各基因型的分布差异也无统计学意义，说明COL1A2 PvuⅡ基因多态性与该地区儿童氟暴露所致氟斑牙无明显的关联。但各基因型分布频率显示，PP基因型在单纯高氟、高氟高碘及对照区的比例呈逐渐升高趋势(9.8%，13.7%，23.3%)，氟碘正常区儿童中野生基因型比例较高。是否与暴露高氟可诱导COL1A2 PvuⅡ位点的碱基突变，而适量碘可抑制突变基因型的发生有关，还需通过进一步分析不同氟碘暴露水平儿童的基因多态性来证实。

本研究中，单纯高氟区和高氟高碘区儿童氟斑牙患病率差异无统计学意义，但从水氟测定结果来看，单纯高氟区水氟浓度为1.8 mg/L，属轻病区，高氟高碘区水氟浓度为3.1 mg/L属中等病区，而单纯高氟区氟斑牙患病率已达到中等病区水平，且氟斑牙指数高于氟碘联合作用区。这说明氟碘联合作用区儿童所患氟斑牙的严重程度略低于单纯高氟区，该结果显示，碘可能对高氟引起氟斑牙有一定的抑制作用，这与洪福贵^〔9〕等的高氟高碘2个因素同时存在时，其危害性更严重的报道不一致。但该文献中水碘浓度为1 508 μg/L，远高于本调查点的水碘浓度，提示适量的碘可能抑制氟的内分泌干扰作用^〔10〕，碘过高则起到相反的作用。氟碘联合作用对儿童所产生的影响有待于进一步探讨。