中国公共卫生  2007, Vol. 23 Issue (4): 393-396   PDF    
引用本文
朱智勇, 丁晓航, 朱函坪, 李岩金, 陈学奎, 沈吉友, 张涛, 何培江, 姚苹苹, 徐芳, 翁景清, 龚华岳, 郭志军, 苏波, 孙淑滨, 粱伟峰. 人用H5N1禽流感疫苗毒种检定及毒种库建立[J]. 中国公共卫生, 2007, 23(4): 393-396.
ZHU Zhi-yong, DING Xiao-hang, ZHU Han-ping, et al. Study on avian influenza (H5N1) vaccine used in human body and establishment of virus seed bank[J]. Chinese Journal of Public Health, 2007, 23(4): 393-396.
人用H5N1禽流感疫苗毒种检定及毒种库建立
朱智勇1, 丁晓航2, 朱函坪1, 李岩金2, 陈学奎2, 沈吉友2, 张涛2, 何培江2, 姚苹苹1, 徐芳1, 翁景清1, 龚华岳2, 郭志军2, 苏波2, 孙淑滨2, 粱伟峰3     
1. 浙江省疾病预防控制中心出血热重点实验室, 杭州310009;
2. 浙江天元生物药业公司;
3. 浙江大学医学院附属第一医院
收稿日期: 2006-10-23
作者简介: 朱智勇(1933-), 男, 浙江台州人, 主任医师, 硕士, 主要从事肾综合征出血热病原和疫苗研究。
通讯作者: 梁伟峰
摘要: 目的 为了研制人用H5N1禽流感疫苗, 按照《中国药典》三部“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程”中的要求, 建立用于生产禽流感疫苗的毒种库。 方法 从国外引进2株H5N1禽流感疫苗的毒种(R1194和R1203), 进行全面检定, 建立三级种子库, 即原代、主代和工作代, 用于疫苗生产。 结果 引进的R1194和R12032个毒株能在胚蛋中大量增殖并稳定传代; 与普通流感A1, A3, B作交叉血凝抑制试验和交叉单向免疫扩散试验表明, 符合H5N1禽流感病毒的特征; 经对血凝素序列测定, 证实了引进的2毒株为H5N1禽流感病毒; 测得的序列与原始株序列比较可知, 2毒株均已去除有毒基因, 属弱毒株; 确定2毒株的P2为原代, P4为主代, P5为工作代。 结论 引进的R1194和R1203毒种为H5N1禽流感减毒株, 可用于禽流感疫苗的生产。
关键词： 禽流感疫苗     毒种     检定     毒种库    
Study on avian influenza (H5N1) vaccine used in human body and establishment of virus seed bank
ZHU Zhi-yong, DING Xiao-hang, ZHU Han-ping, et al     
Key Lab of Vaccine against Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome, Center for Disease Control and Prevention, Zhejiang Province, Hangzhou 310009, China
Abstract: Objective To develop avian influenza (H5N1) vaccines used in human body.To establish the virus seed bank used to produce avian influenza vaccines according to "Requirements for Bacterial and Viral Strains-Seeds Used for Production and Quality Control of Biologics" from the book called PHARMACOPO EIA OF THE PEOPL E'S REPUBL IC OF CHINA Volume Ⅲ. Methods To importe from abroad and checked up entirely the two-virus seeds of R1194 and R1203 for the avian influenza vaccine production.To establish three virus seed lot systems (seed bank) i.e.the primary seed lot, master seed lot and working seed lot. Results The two seeds of avian influenza vaccines can be multiplied greatly and passaged steadily in egg embryos; The cross hemagglutinin-inhibiting test and immunodiffusion test with the antigen and antibody of human influenza A1, A3 and B and avian influenza H5N1 indicated that the above two seeds had the character of avian influenza H5N1.The complete HA genes, that were sequenced, approved that the seeds were avian influenza H5N1 viruses.The virulence genes were deleted and the two seeds belonged to feebleness virulence strain by sequence compared with wild types.The two seeds, which were passed 2, 4 and 5 times in egg embryos respectively, were confirmed as the primary seed lot, master seed lot and working seed lot. Conclusion The two-virus strain R1194 and R1203 imported from abroad can be used to produce the avian influenza vaccines.
Key words: avian influenza vaccine     virus seed     check up     virus seed bank    

自2003年12月~2006年10月16日, 世界各地共发生由禽传人的H5N1禽流感病例256人, 死亡151人, 病死率高达59 % 〔1〕。由于流感病毒极易变异, 一旦获得在人间传播的能力, 数亿人的生命将受到威胁, 其潜在危害性远超过严重急性呼吸道综合征(SARS), 已引起WHO和世界各国政府的重视〔2〕, 并把人用禽流感疫苗的研究提到重要位置〔3〕。2005年我们从国外引进2株H5N1亚型禽流感病毒, 用于疫苗的研究, 由于内容较多, 现把研究结果分3部分:(1)疫苗毒种的检定及毒种库的建立; (2)疫苗检定评价; (3)疫苗免疫动物的效果观察。本文报告第一部分。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)毒种: NIBRG-14株(简称R1194)(英国国家生物制品检定所)。该毒株是1194株(A/Viet Nam/1194/2004 H5N1)和PR8株(H1N1)2病毒, 通过反相遗传的方法改造而成; VNH5N1-PR8/CDC-RG株(简称R1203)(美国疾病控制中心), 该毒株是用1203株(A/VietNam/1203/2004H5N1)和PR8株(H1N1)病毒, 通过反相遗传的方法改造而成。2种病毒均在胚蛋中传二代(P2)。(2)血清:禽流感病毒H5血凝素及抗血清(英国国家生物制品检定所); A1、A3、B型人流感病毒血凝素及抗血清(英国国家生物制品检定所); R1203抗血清(本实验室用R1203疫苗免疫家兔获得)。(3)无致病菌(SPF)鸡蛋(北京实验动物中心SPF鸡群)。

1.2 方法

(1)血凝抑制试验和单向免疫扩散试验:按常规法。(2)病毒滴度测定:按常规鸡胚感染法, 每稀释度接种4只胚蛋。(3)无菌试验和外源因子检查:按现行版《中国药典》的要求测定〔4〕。(4)毒种免疫源性测定:病毒经灭活、浓缩、纯化后, 用不同剂量的血凝素经大腿肌肉接种210~215 kg家兔4只, 14 d后加强1针, 首针后28 d采血, 测定血凝抑制抗体和中种抗体。(5)血凝素序列测定:根据H5的核酸序列, 设计一对特异性引物, 经RT-PCR扩增H5基因, 通过T-A克隆, 将其插入载体, 转导大肠埃希菌, 筛选阳克隆, 提取质粒, 由上海生物工程研究所进行测序。(6) R1194和R1203的原始株序列:来源于美国国家生物信息中心基因库(NCBIGenBank)〔5, 6〕。(7)电子显微镜图片:由浙江医学科学院电镜室协助拍摄。

2 结果 2.1 病毒滴度测定

毒种接种胚蛋20只, 经培养后, 将血凝阳性的尿囊液混合测得的血凝滴度和病毒滴度见表 1。

表 1 传代的病毒滴度

从表 1可见, 2个毒种适应在胚蛋中增殖, 均有较高的血凝滴度和病毒滴度, 并能稳定传代。

2.2 血凝抑制试验

用R1194, R1203, A1, A3, B型的抗原与它们的抗血清作交叉血凝抑制试验, 见表 2。

表 2 各型流感病毒交叉血凝抑制试验(倒数)

从表 2可见, 抗血清对同型的抗原有较高的血凝抑制滴度, 对其他型别也有一定的交叉, 交叉滴度大都在≥1：40。

2.3 单向免疫扩散试验

用R1194, R1203, A1, A3, B型流感病毒的抗原(含量约60 μg HA/ml左右)与它们的抗血清作交叉单扩试验结果见表 3。

表 3 各型流感病毒交叉单向免疫扩散试验

从表 3可见, 各型抗血清仅对同型抗原起反应, 对其他型别无交叉。

2.4 2毒株H5血凝素(HA)序列测定与原始株的比较 2.4.1 R1194(P5) HA测得的核苷酸序列(图 1)
图 1 R1194(P5) HA核苷酸序列

2.4.2 R1194株与原始毒株不同核苷酸序列部位(图 2)
图 2 R1194株与原始毒株不同核苷酸序列

从图可知:R1194株(P5)的核苷酸序列与原始毒株比较, 去了1022~1033的12个碱基(4个氨基酸), 在1015, 1034和1036位置上的A由C取代。

2.4.3 R1194株与原始毒株不同氨基酸序列部位(图 3)
图 3 R1194株与原始毒株不同氨基酸序列

从图 3可知, R1194株(P5)的氨基酸序列与原始毒株比较, 去了RRRK 4个氨基酸, 下一个K由T取代, 现已知含有R-R-R-K-K-R氨基酸序列的禽流感毒株属高致病力毒株〔7〕。

2.4.4 R1203(P5) HA测得的核苷酸序列(图 4)
图 4 R1203(P5) HA核苷酸序列

2.4.5 R1203株核苷酸序列与原始株比较后的不同部位(图 5)
图 5 R1203株与原始株不同核苷酸序列

从图 5可知, R1203株(P5)的核苷酸序列与原始毒株比较, 与R1194(P5)株完全一样。

2.4.6 R1203株与原始毒株不同氨基酸序列部位(图 6)
图 6 R1203株与原始毒株不同氨基酸序列

从图可知:R1203株(P5)的氨基酸序列与原始毒株比较, 也与R1194(P5)株一样。

2.4.7 序列同源性

R1194(P5)与R1203(P5)的核苷酸序列同源性为99.1%;R1194(P5)与R1194(P10)的氨基酸序列完全相同; R1203(P5)与R1203(P10)仅2个氨基酸不同。

2.5 无菌试验和外源因子检查

符合现行版《中国药典》的要求。

2.6 毒种免疫源性测定

R1194(P5), R1203(P5)2毒株, 各制成15μg HA/0.5 ml, 免疫家兔4只, 2针(隔14 d), 首针后28 d, 测得血清中的中和抗体滴度均≥1：40。

2.7 电子显微镜观察

R1194(P5), R1203(P5)2毒株的尿囊培养液, 经浓缩、纯化的电镜照片均可看见完整的病毒颗粒。

2.8 毒种库的建立

根据现行版《中国药典》三部通则中“生物制品生产和检定用菌毒种管理规程” 〔4〕的要求, 将R1194和R1203毒种建立了三级种子库; 即原代、主代和工作代。(1)原代:引进的毒种P2作为原代。(2)主代:原代在胚蛋中传2代P4作为主代。(3)工作代:主代在胚蛋中传1代P5作为工作代。

3 讨论

据报道, 禽用禽流感疫苗的研究已取得突破性进展〔8〕, 基本解决禽类的预防问题, 已规模生产。但人用禽流感疫苗的研究仍在进行中。据国际制药企业协会联合会(IFPMA)2006年5月的统计〔9〕, 全球H5N1禽流感疫苗人体观察的地区有法、美、英、德、日、澳、俄、比利时、(中国未列入)等, 并取得较大的进展〔10-13〕。所用的毒种有NIBRG-14, NIBRG -4, VI1203, US-NIAID, A/H.K./492/1997等, 其中也包括本研究的2株。一旦H5N1禽流感病毒获得由人传人的能力, 此疫苗的需求量必然极大, 目前国际上任何一家流感疫苗生产厂都不可能满足供应, 因而凡生产普通流感疫苗的厂家, 必须做好生产禽流感疫苗的技术贮备, 以供急需〔14〕。

本文引进的2株H5N1亚型禽流感病毒, 经序列测定表明, 均已去除毒性基因, 即血凝素基因中表达R-R-R-K-K-R的氨基酸序列, 事实上, 仅去除有毒基因的H5N1毒株尚不能用于疫苗生产, 还必须适应在胚蛋中增殖的能力, 才能用于制造疫苗, 故还需将去除毒性基因的毒株通过反向遗传技术, 将减毒株的HA和NA基因及胚蛋适应株A/PR/8的其他6个基因和它的4个复制酶基因分别克隆到质粒上, 共同转染Vero细胞, 获得遗传重配的病毒株。研究表明, 经过减毒的重配株R1194和R1103均能在胚蛋中大量增殖。

经对2种减毒株检定时发现, 在血凝仰制试验中, 普通流感病毒A1, A3, B型与H5N1禽流感病毒之间均有一定的交叉反应, ,滴度大都在≥1：40, 这不能表示普通流感病毒和H5N1病毒的抗体, 具有相互保护的能力, 从单扩试验表明, 它们之间没有交叉; 经中和试验也证明它们之间没有相互中和的能力。因而判断禽流感疫苗的质量, 不能仅靠血凝抑制试验的结果来决定疫苗接种后的免疫效果, 更重要的是观察中和抗体的产生和它的效价。

(参加此项研究的还有:谢荣辉, 赵芝雅, 金美珍, 丁云龙, 李枫, 黎丹, 袁勇等。)

参考文献
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