肠道病毒(EV)可引发多种感染, 并且发病又多以综合征出现, 病情轻重悬殊, 婴幼儿患者可暴发严重心肌炎或重症肺炎, 尤其新生儿期的暴发流行可致死亡.一种综合征可由不同病毒所引起, 同一种(型)病毒可以导致不同综合征是肠道病毒属病毒感染的普遍现象.患者感染肠道病毒后多数为亚临床表现, 不易被发现, 因此, 有效而及时地作出病原学诊断难度较大.目前除脊髓灰质炎外, 尚无疫苗可供预防, 是当前严重影响人类健康的重要病原之一.因此, 建立快速、简便、特异的病原学诊断方法, 研制广谱的抗病毒药物是今后的研究热点.现将近年来国内外有关检测技术和抗病毒药物研究进展综述如下.

1 肠道病毒检测 1.1 病毒分离培养

利用组织培养技术从感染部位或传染源分离出病毒并鉴定其特异性血清型是病毒性疾病诊断的金标准。病人粪便标本是最常采集的标本, 其他如咽拭子、脑膜炎患者的脑脊液、心包炎患者的心包积液、手足病患者的疱内渗出液、结膜炎患者的眼部分泌物等都是常用分离病原的标本。分离时所选用的细胞系都系人源或猴源的细胞, 它们都具有肠道病毒受体, 对所要分离的病毒敏感。常用的有Hep-2、Hela、巨核细胞(MK)和一些猴源的传代细胞如Vero等, 肠道病毒能在敏感细胞中增殖并致细胞产生病变。病毒培养对缩短抗生素治疗和住院期有积极作用, 其定型诊断对流行病分析有重要意义, 但是, 病毒的分离鉴定繁琐、费力、耗时, 一般需要1周才能观察到细胞病理反应, 且费用高、敏感性低, 并需要较高的专业知识及实验室设备, 更重要的是许多肠道病毒不能进行细胞培养, 或者可以培养但不出现细胞病理效应, 如柯萨奇A组病毒, 往往贻误特异性治疗, 同时对诊断某些肠道病毒血清型和脑膜炎的敏感性也欠佳, 给临床诊断和快速检测工作带来困难和挑战^〔1〕。

1.2 血清学鉴定

分离病毒和利用组合血清中和试验是对病毒定型的重要方法。肠道病毒的血清学鉴定中, 一般单份血清抗体效价无意义, 因为健康人血清中都有一定效价; 而取双份血清检测, 恢复期抗体效价呈4倍以上升高, 有诊断意义, 因此, 多选用组合血清。此方法在检测中不适用于早期诊断, 可作为回顾性诊断; 且由于肠道病毒血清型别众多, 临床使用检测价值有限, 而多为流行病学采用^〔1〕。利用酶联免疫吸附试验(ELISA)捕捉法或间接法检测早期病人血清中的IgM和IgG抗体, 是较常用的检测指标, 尤其以柯萨奇B组病毒的感染诊断较多, 病毒抗原可从心、脑、脾、胰、肝和胸腺等多器官检出。

1.3 PCR技术

由于各型肠道病毒具有共同基因组序列, 因而PCR技术问世后即被用于检测肠道病毒。PCR可检出几乎所有血清型。PCR检测材料用量少、快速、灵敏度高且具特异性, 并可通过设计不同的引物进行病毒分型, 用于检测相当宽的肠道病毒血清型。EV-PCR一般可在收到标本后5~24 h内提供诊断结果, 是目前较理想的诊断技术^〔2-5〕。EV-PCR比传统细胞培养法的检出率高。原因是不论病毒活性在标本处理过程中是否失活, 或病毒增殖过程中形成的缺陷性病毒能否感染细胞而影响培养结果, 其核酸相对稳定仍能被检出。Sawyter等^〔2〕、Rotbart^〔3〕等、Hamiltion^〔4〕等和Muir^〔5〕等分别报道PCR从脑脊液、血、尿、粪、咽拭标本中检出肠道病毒, 其灵敏度达88%~100%, 特异性为83%~97%。与细胞培养法比较, PCR检出率明显提高, 估计敏感性增强10~1000倍。在临床检测方面, Manzara^〔6〕等用免疫学和分子生物学综合方法, 从临床标本中检测肠道病毒, 并予以定型。Craig^〔7〕等将酶联免疫吸附试验(ELISA)方法与PCR比较, 证实了二者的互补性。Billaud^〔8〕等建立的PCR方法可同时检测并区别上呼吸道标本中人轮状病毒和肠道病毒, 拓宽了PCR的应用。在公共卫生监测方面, Gantzer^〔9〕等用PCR对废水中的肠道病毒进行检测, 废水经过玻璃粉或玻璃棉处理, 吸附、浓缩后用RT-PCR技术使肠道病毒检出率大大提高。Kellogg^〔10〕等人建立的RT-PCR-DNA酶免疫法(RT-PCR-DEIA), 可进一步缩短检测时间, 其特点是用一种对热稳定的r Th聚合酶代替转录酶和Taq聚合酶, 用地高辛-dU TP标记终产物, 然后用微孔杂交法验证, 所需时间不到4 h。Jean^〔11〕等发展了基于核酸序列扩增的酶联免疫吸附法(NASBA-ELISA), 其为一种恒温的RNA扩增技术, 整个扩增过程在40℃下进行, 标准的反应体系包括禽类成骨髓细胞瘤毒(AMV)逆转录酶、T7RNA合成酶、Rnase-H、dNTP、NTP、2个特殊的引物和适宜的缓冲液, 然后用酶联免疫法对扩增产物进行证实, 其优点在于直接对RNA扩增, 不需要热循环仪, 无需特殊的仪器, 已成功应用于水果、蔬菜中甲型肝炎病毒(HAV)的检测。

近年出现的荧光实时定量PCR应用与靶序列直接结合的荧光探针可将生成的RNA加以定量, 其特点为检测快速(从样品准备到数据分析只有3 h)、敏感性强、扩增产物可直接定量、密闭系统防止交叉污染等, 这些优点奠定了其在肠道病毒检测中的广阔应用空间。Nijhuis^〔12〕等利用肠道病毒属基因组5'端的高度保守序列设计引物, 能够检测出肠道病毒属的所有血清型, 并且与RNA科其他属(肝炎病毒属、副埃可病毒属)病毒无交叉反应, 对来自临床的样本如血清、血浆、鼻咽拭物、脑积液等检测结果显示, 其灵敏度与病毒的组织培养相当, 甚至更好。使用TaqMan PCR具有自动化、易标准化的特点, 使其可能成为病毒检测中组织培养的替代方法。

2 抗肠道病毒药物 2.1 普拉康纳利

普拉康纳利(Pleconaril)^〔13〕为近年来首先试用于临床的、仍在研究的可抑制肠道病毒复制的药物。该药口服吸收良好, 具有广谱抗微小核糖核酸病毒活性, 其主要通过与病毒的蛋白衣壳结合而干扰病毒对宿主细胞的吸附和脱壳^〔13〕, 能对90%以上的肠道病毒血清型起作用^〔14〕。该药在鼻分泌物及中枢神经系统中的浓度比血清浓度高数倍, 因而更适用于肠道病毒呼吸系统感染或中枢神经系统感染的治疗。普拉康纳利已经被应用于肠道病毒呼吸系统感染、中枢神经系统感染、危及生命的新生儿肠道病毒感染及免疫缺陷者的慢性肠道病毒感染等疾病中, 临床显示有减轻症状、缩短病程等效果, 不良反应轻微, 主要为恶心及腹痛, 多可以耐受。该药是一种有应用前景的候选药, 对其进一步的研究将有助于肠道病毒感染的特异性治疗。

2.2 蛋白酶抑制剂

肠道病毒所属微小核糖核酸病毒属(Picornavirus)病毒的侵染细胞后, 其基因组首先转录成1个前体蛋白多聚体, 而该多聚体需要在病毒3C蛋白酶的裂解作用下才能产生其他结构蛋白和蛋白酶, 完成整个生命周期。3C蛋白酶是Picornavirus病毒属病毒复制所必需的特异性蛋白酶之一, 同时对其基因组研究发现, 编码3C蛋白酶的基因序列高度保守, 因此, 3C蛋白酶就成为抗小RNA病毒药物开发的重要靶标^〔15〕。目前依据3C蛋白结构设计出的抗病毒物质有多种, 其中AG7088是最有希望成为临床药物的物质之一。AG7088为抗人轮状病毒而设计, 在所试验的48个血清中均有抑制效果。在细胞培养水平检测AG7088抗病毒谱的结果显示, 对埃可病毒(EV 11)、肠病毒(ETV 70)、柯萨奇病毒(CVA 21、CVB 3)、巨细胞病毒(HCMV AD169)、单纯疱疹病毒(HSV-1)均有直接抑制作用, 半数致死浓度(EC₅₀)和90%致死浓度(EC₉₀)分别为0.003~0.081 μmol/L和0.018~0.261 μmol/L, 而其毒性浓度为 > 1 000 μmol/L, 治疗系数为12 346~333 333之间。在作用时间效果实验中, AG7088在感染后6 h用药仍然具有良好的抗病毒效果^〔16〕。因此, 以病毒颗粒结构为基础设计的抗病毒物质普拉康纳利和AG7088及其衍生物是目前最有希望的治疗小RNA引发疾病的临床药物。

2.3 抗病毒中药

抗肠道病毒植物药的筛选为寻找开发新的抗病毒中药制剂开辟了广阔的前景。中医药和民族民间医药作为我国的传统医药, 对有关病毒引起的疾病及其防治积累了丰富的经验, 从中发掘新的抗病毒有效物质和天然药物方面有着广阔的前景。我国科研人员利用组织培养筛选抗病毒中草药已几十年的历史, 已经筛选出近百种, 其中用于抗肠道病毒的天然植物药物有苦参、黄芪、大黄、水飞蓟、金银花、虎杖、空心莲子草、贯众、山豆根、败酱草、高山红景天、大蒜素、人参皂苷和薄荷醇提取物等, 这些均被证明在体外或具有灭活病毒、或能抑制病毒增殖, 有保护培养细胞的作用^{〔17, 18〕}。目前用于抗肠道病毒药物的筛选模型主要是体外细胞培养模型, 通过观测经病毒和药物处理后的细胞存活状况、病毒的存活数量, 以此反映药物的作用效果。观测指标主要有细胞病变(CPE)、利用噻唑蓝或中性红等染料摄入法检测细胞存活率、RT-PCR检测病毒RNA等。国内研究较深入的为苦参、大黄、贯众、高山红景天多糖等。研究表明, 苦参总碱可以进入细胞内发挥抗病毒作用, 能够抑制病毒蛋白的合成, 从而可阻断病毒的复制过程, 达到治疗效果。同时苦参总碱还能在小鼠体内证明有抑制病毒血症, 抑制病毒在心肌中增殖及抑制心肌炎症发展的作用^〔19〕。孙非^〔20〕等对高山红景天多糖的研究发现, 该多糖能明显的抑制体外培养心肌细胞在受到柯萨奇B₃病毒感染后导致的心肌酶释放; 显著降低病毒在心肌细胞中的增殖量; 其半数有效抑制浓度为150 mg/L; 有效浓度平均抑制率为71.3%, 表明高山红景天多糖对在SD大鼠心肌细胞内增殖的柯萨奇B₃病毒具有一定的抑制作用。目前对于中草药抗病毒的研究多集中在粗提物的初步研究, 对机制的研究仅仅是从病毒侵染的时间来推断活性成分的可能作用, 无法提供确切的作用机制也制约了中药产品走向国际市场的步伐。

3 展望

虽然肠道病毒感染后通常无症状而被忽略, 但其普遍分布于世界各地, 感染广泛存在, 并且常引起暴发, 导致数量比平常更多的病人发展成为临床病例, 甚至死亡。因此, 对肠道病毒的监测、检测和药物治疗应该给以足够重视。PCR等检测技术的发展使得从血清、心肌细胞、粪便、脑脊液、环境水中均能检测出肠道病毒基因组, 为其诊断提供证据; 同时, 也为研究肠道病毒与疾病的关系提供大量科学数据。对于肠道病毒的治疗目前主要以对症治疗为主, 国外在研制化学合成药物方面保持领先的同时, 正在抓紧时间占领国际天然药物市场。我国的天然资源丰富, 已经查明的植物品种数量占世界的第3位, 加上数千年的中医中药和民间医药的宝贵经验, 我国具有开发和利用天然药物的独特优势, 也将成为开发防治肠道病毒感染药物的重要来源。