脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis, PFGE)分型为一种重复性好、分辨率高的细菌分子分型方法, 被广泛应用于细菌感染的分子流行病学研究。近年来, 杭州地区发生多起甲型副伤寒暴发疫情, 部分地区反复多次发生, 已成为严重的公共卫生问题。本文应用PFGE分型技术分析了2002~2005年杭州地区5起暴发疫情和10起散发病例的分子流行病学特征, 并进行抗生素敏感性观察。现将结果报告如下。

收集2002~2005年杭州市L县和X区甲型副伤寒患者血培养及粪便中分离的甲型副伤寒沙门菌171株, 其中分离自L县3起暴发疫情103株, 散发病例3株; 分离自X区2起暴发疫情58株, 散发病例7株。菌株均由杭州市疾病预防控制中心微生物检验科依据GB 16001-1995进行鉴定。鉴定试剂:肠杆菌科鉴定试条ATB ID 32 E (法国生物梅里埃公司); 沙门菌诊断血清(成都生物制品所、兰州生物制品所), 均在有效期内使用。

(1)主要仪器:CHEF DRII脉冲场电泳仪、BioRad凝胶图像分析系统、BioRad紫外分析仪(美国BioRad公司)。(2)主要试剂:蛋白酶K (上海Sangon公司); XbaI (日本TaKaRa公司); Seakem Gold琼脂糖(美国Cambrex公司)、0.5×TBE (自行配制); Marker沙门菌Braenderup血清型H9 812株(中国疾病预防控制中心惠赠)。

选择14种抗生素, 采用WHO推荐的改良Kirby-Bauer纸片法进行药物敏感试验。14种抗生素药敏纸片、Mueller-Hinton琼脂(杭州微生物试剂厂), 均在有效期内使用。结果判定参照卫生部制定的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》 (WS/T 125-1999)。质控菌株为大肠埃希菌ATCC 25 922、铜绿假单胞菌ATCC 27 853、金黄色葡萄球菌ATCC 25 923, 均为本实验室保存。

从每起暴发疫情分离菌株中各选择1株以及散发病例分离株作为代表菌株, 计15株; 操作方法按照美国疾病预防控制中心PFGE标准方法^〔1〕并略加改进: Luria-Bertani (LB)平板划菌37℃过夜, 无纤维棉签沾取细菌到2.5 ml细菌悬浮液A₆₀₀比浊, 吸光度1.2~1.4之间。于400 μl菌液加入20 μl蛋白酶K (20 mg/ml), 再与等体积的预熔1%Seakem Gold琼脂糖:1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液混匀后, 制备琼脂块。用50μg/ml蛋白酶K液消化2 h。分别用15 ml双蒸水和TE洗2和4次, 消化和洗涤均在54℃摇床170 r/min中进行。然后切胶至1.5 ml PE管中, 于37℃水浴中以25 U XbaI酶切2 h。将胶条包埋于1%Seakem Gold琼脂糖〔0.5×Tris-硼酸(TBE)缓冲液〕。CHEFO Ⅱ电泳仪电泳19 h, 脉冲电泳起始转换时间为2.2 s、最后转换时间为63.8 s、电压为6 V/cm、角度120°, 电泳液为0.5×TBE缓冲液, 电流控制在140 mA左右, 电泳缓冲液温度保持在14℃。溴化乙锭染色, 凝胶图像分析系统保存结果。分型判别标准:按文献判别标准^〔2〕, 酶切后图谱完全一致, 判定为同一型; 酶切后图谱有1~3条条带不同者, 判定为菌株间关系较密切; 酶切后图谱如有3条以上条带不同者, 则判定为菌株间关系不密切。同时采用Dice相似性系数评估PFGE图谱间的相似性^〔3〕, 应用Quantity one软件计算电泳条带分子量。

分型结果可见, 15株甲型副伤寒沙门菌分别产生19~20条条带, 可分为A、B、C、D等4种型别, 带型变化分别发生在651.1, 401.6, 327.5, 74.6, 41.1 Kb处, 4型之间分别有1~4条电泳条带的差异(图 1)。

图 1

M:Marker (XbaI酶切H 9812株); 1:A型; 3~7:B型; 2, 8, 9, 11~15:C型; 10:D型 图 1 15株甲型副伤寒沙门菌PFGE分型图谱

其中分离自2002年3月L县1起暴发疫情的菌株为A型; 分离自2005年7月、8月L县2起暴发疫情以及2005年8月该县3起散发病例菌株为B型; 分离自2004年12月、2005年9月X区2起暴发疫情以及2005年9, 10月该区6起散发病例的菌株为C型; 分离自2005年9月X区1起散发病例的菌株为D型。4型菌株之间的Dice系数分析表明, 除分离自X区2005年的1株散发菌株外(D型), 其他14株菌株间PFGE型别的Dice系数均 > 0.9。

4个型别的甲型副伤寒沙门菌对头孢唑啉、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃唑酮均敏感(100%), 对复方磺胺甲唑和利福平均100%耐药。其中94株A型菌株对多西环素耐药率为6.7%, 对四环素耐药率为0, 对氨苄西林耐药率为100%;12株B型菌株对多西环素和四环素耐药率均为0, 对氨苄西林耐药率为16.7%;64株C型菌株对多西环素耐药率为20.3%, 对四环素耐药率为4.7%, 对氨苄西林耐药率为14.1%;1株D型菌株对多西环素和四环素耐药率均为0, 对氨苄西林耐药率为100%。

本文结果显示, 除分离自X区2005年的1株D型散发菌株外, 其他14株菌株间PFGE型别的Dice系数均 > 019, 表明2个地区的暴发或散发疫情分离到的甲型副伤寒沙门菌株关系密切, 同属一个克隆系。其中占比例较大的A型与C型分别与朱水荣等^〔4〕2001~2004年分离自临安与义乌、常山与温岭等地菌株的PFGE分型一致, 表明杭州地区2002~2005年分离自L县和X区的流行菌株与浙江省其他地区的流行菌株也存在密切关系。

本文结果显示, 分离自L县2005年7月和8月的2起暴发疫情和同年8月的3起散发病例菌株的PFGE图谱完全一致, 同属B型; 分离自X区2004年12月和2005年9月的2起暴发疫情和2005年9月和10月的6起散发病例菌株的PFGE图谱完全一致, 同属C型。提示暴发菌株与散发菌株间均呈现极为紧密关系, 从发病时间推测, 散发病例可能均属继当地暴发流行后的散发流行, 其传染源可能与暴发传染源相同, 即导致暴发的传染源可能未完全被发现或消毒不彻底; 或者直接源自暴发病例或带菌者。

同时, 杭州地区已经开始有多重耐药的甲型副伤寒沙门菌菌株出现, 应加强菌株耐药性的监测, 根据药敏结果来指导临床用药和接触人群的预防性用药, 从而更有效地防治甲型副伤寒。