脂筏是脂质双层内含有特殊脂质的蛋白质的微区, 具有低流动性, 呈现有序液相, 富含胆固醇和鞘磷脂^〔1〕。与糖基磷脂酰肌醇(GPI)相连, 或被肉豆蔻酸酰化, 是脂筏分子主要的2种蛋白修饰形式。膜上许多结构可通过被GPI锚固的形式作为细菌、病毒以及毒素的受体。脂筏介导质膜的内吞作用、病毒颗粒的装配及出芽过程, 以及跨膜信号传导等重要的生物学过程^〔2〕。脂筏具有不溶于非离子去污剂的特点, 因此, 又称为去污剂不溶性富含糖脂复合体(DIG)。利用这一特点, 采用非离子去污剂TritonX-100成功地分离出脂筏, 并经鉴定证实。现将结果报道如下。

材料与方法

(1)材料:培养基RPMI 1 640和胎牛血清(美国Gibco公司); 甲基-β环糊精(MβCD)、抑肽酶(美国Sigma公司); 聚乙二醇对异辛基苯基醚(TritonX-100), Na₃VO₄, 氟代甲烷苯磺酸, 蔗糖(日本和光纯药工业株式会社); 一抗羊抗兔GM 1单克隆抗体(日本COSMOBIO株式会社); 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗及增强化学发光显色试剂盒(瑞典Amersham Biosciences公司)。HSB 2细胞(日本大阪大学医学部森康子博士惠赠)。(2)细胞培养:HSB 2细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1 640, 调整细胞数为5 ×10⁷/ml。(3)非离子去污剂法提取脂筏:所有步骤均在0~4℃下进行^〔3〕。收集5 ×10⁷个细胞, 用1 ml裂解缓冲液悬浮细胞, 裂解缓冲液成分:1% TritonX-100, 5 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA), 1 mmol/LNa₃VO₄, 1 mmol/L氟代甲烷苯磺酸, 75 U抑肽酶; 对照组加入2 mmol/L甲基-β环糊精(MβCD), 它能破坏胆固醇和磷脂, 从而破坏脂筏, 但对细胞膜的完整性无影响。匀浆器轻轻打碎细胞20次, 将细胞裂解物与相同体积的80%蔗糖混合, 放入离心管底部, 依次加入30%, 5%的蔗糖液。4℃, 超速离心200 000 g, 18 h, 依次吸出离心条带, 每次1 ml, 共可获得11个去污剂不溶性富含糖脂复合物(DIG)。(4)十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和免疫印迹法(Westen blot):取出的各区段DIG样品经SDS-PAGE电泳, 通过电转移法转移至硝酸纤维素膜上, 在含5%脱脂奶粉和0.02%吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS)中4℃过夜封闭后加入羊抗兔GM1单克隆抗体(1: 500), 37℃孵育60 min, PBS液漂洗10 min ×3次, 加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG (1:1 000), 37℃作用30 min, PBS液漂洗10 min ×3次, 最后用增强化学发光法进行显色, 观察显影蛋白条带。

结果

离心结束后, 在蔗糖密度梯度内, 在离心管5%~30%交接面处有1层去污剂不溶性絮状白色沉淀漂浮, 此为去污剂不溶性复合物所在的位置。通过SDS-PAGE电泳分离出来, Western blot显示, 化学发光法进行显色后在相对分子质量11 500处可见条带, 表明提取的去污剂不溶组分中有神经节苷脂GM 1的表达, 对照实验的结果为阴性, 见图 1。

讨论

与普通质膜相比, 脂筏具有特殊的脂质组成和更高的脂质蛋白比。因此, 在低温下, 以非离子型去污剂, 如Tri-tonX-100抽提细胞裂解物时, 脂筏结构及其内的成分因具有抵抗去污剂溶解的能力, 而在溶液中聚集形成不溶性复合物^〔4〕。由于其密度较低, 可利用蔗糖密度梯度离心法将脂筏组分离心收集。用该方法分离的脂筏纯度相对高, 其生物学特性也基本上不会受到破坏。在脂筏的成分中有2种特异的分子, 一种是凹陷蛋白, 它特异性地定位于质膜微囊上, 相对分子质量为21 000~24 000;另一种是神经节苷脂GM1, 相对分子质量为11 500, 定位于各种类型的脂筏中。在鉴定分离得到的组分是否为脂筏时, 可将这2种分子作为标记^〔5〕。本实验采用Western blot分析法, 检测所获得的去污剂不溶组分中神经节苷脂GM 1的表达, 从而证实提取物为脂筏组分。目前发现有的脂筏可溶于去污剂Brij 98, 而不溶于TritonX-100, 所以分离不同特性的脂筏要使用不同类型的去污剂。除了用非离子型去污剂抽提脂筏外, 还有非去污剂法, 如碳酸钠法, 非去污剂法可以保护脂筏上的脂溶倾向的信号分子^〔6〕。因此, 根据不同的实验需要采用不同的分离方法。