阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)属于肠杆菌属的1个新种^〔1〕。本文采用目前应用最广、在微生物鉴定方面得到公认的肠杆菌科细菌生化鉴定试剂(API20E)分析了阪崎肠杆菌的生化反应特性, 并利用阴沟肠杆菌噬菌体进行裂解试验测定了阪崎肠杆菌的易感性, 对奶粉中18株阪崎肠杆菌分离株和4株美国典型菌种保藏中心(ATCC)参考菌株进行了表型分类。旨在对奶粉中阪崎肠杆菌分离株的表型特征进行分类, 以便准确地对其鉴别。现报告如下。

1 材料与方法 1.1 材料

(1)标准菌株:阪崎肠杆菌ATCC29544, ATCC29004, ATCC51329, ATCC12868。(2)阪崎肠杆菌分离株:分离自国内市场奶粉抽查样品, 共18株。经AP120E和英国荧光快速微生物鉴定/药敏分析仪, 2种系统对阪崎肠杆菌的鉴定概率(%)。检验检疫菌种保藏中心(IQCC)10403-1(98.4, 98.48);10403-2(98, 94.89);10403-3(98.4, 99.95);10403-4(98.4, 92.30);10403-5(98, 92.37);10403 -6(98, 99.35);10403-7(98.4, 99.3);10403-8(98.4, 97.96);10403-9(98, 97.26);10403-10(98.4, 95.96); 10403-11(98, 99.6);10403-12(98.4, 99.26);10403-13 (98, 99.26);10403-14(98, 100);10403-16(98.4, 99.51); 10403-17(98, 98.22);10403-18(98, 99.35);10403-23 (98, 99.6)。(3)试剂与培养基:脑心浸液肉汤(BHI)(美国Di-fico公司); 胰酪胨大豆胨琼脂(TSA)、营养琼脂(北京陆桥公司); API20E (法国生物梅里埃公司); 阴沟肠杆菌噬菌体(广州虎克生物技术有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 菌株培养

将每株参考菌株和分离菌株分别接种于灭菌BHI肉汤, 36℃培养24 h, 再接种于TSA斜面, 36℃培养24 h, 作为储备菌株, 试验时从储备菌株用接种环接种于营养琼脂, 划线分离37℃培养24 h形成单菌落。

1.2.2 阪崎肠杆菌的生化特征及噬菌体裂解实验

API20E实验:将试验菌株, 按照API20E使用说明进行操作, 36℃培养22~24 h后, 按照说明书滴加相关试剂, 观察和记录结果。噬菌体裂解实验:接种针轻点生长于营养琼脂上的单个纯菌落, 通过管壁研磨使其均匀分散在2 ml普通肉汤中, 约100 CFU/ml, 取1接种环(约100μl)菌悬液涂布于经过预处理(90 mm, 20 ml, 放42~44℃恒温箱30 min使表面干燥)的营养琼脂表面, 干燥(同前), 取100μl阴沟肠杆菌噬菌体滴加于营养琼脂表面, 36℃培养22~24 h, 观察裂解结果, 以融合裂解、不完全裂解和不裂解记录实验结果。

1.2.3 阪崎肠杆菌的表型特征分类

以ATCC参考菌株在API20E上反应的生化特征为生物1型, 对于阪崎肠杆菌分离株, 去掉相同的生化反应, 保留不一致的生化反应项目进行分析, 每1种与参考菌株不同的生化特性为1种新的表型。

2 结果 2.1 API20E测定结果

API20E共有21项生化反应, 主要区别在于伏-普试验(VP)、肌醇和山梨醇方面, 4株ATCC参考菌株生化反应一致, 鉴定数值为3305373, 7株分离株与参考菌株一致(38.9%), 将参考菌株的表型特征定义为生物1型, 按照伯杰氏细菌手册分类方法^〔2〕, VP、肌醇、山梨醇分别为+、+、-, 与生物1型相比, 肌醇阴性为3株, 比例为16.7%, 为生物2型; VP阴性9株, 比例为50%, 为生物3型; 山梨醇阳性2株, 比例为11.1%, 为生物4型; 尿素阳性, 1株, 比例为5%, 为生物5型; 精氨酸阴性1株, 比例为5%, 为生物6型。

2.2 阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验

4株ATCC阪崎肠杆菌参考菌株和18株分离菌株经阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验, 1株分离株被融合裂解, 编号为IQCC10403-18, 1株为不完全裂解, 编号为IQCCl0403-13。

3 讨论

1999年, Nazarowec-white和Farber对临床和食品中分离到的17株阪崎肠杆菌以及1株ATCC29544进行了表型特征分类^〔3〕, 以ATCC29544参考菌株表型反应作为生物1型, 与该生化反应模式比较, 山梨醇阳性反应株列为生物2型, VP阴性为生物3型。本实验采用此方法, 对22株(包括4株ATCC参考菌株)进行分析, 但实验结果存在差异。首先, ATCC参考菌株反应数值为3305373, 而不是3304373, 也即差异在VP实验。本实验4株参考菌株VP反应均为阳性, 经典考夫曼方法重复实验结果也为阳性, 伯杰氏手册中阪崎肠杆菌的VP反应阳性率为90%~100%^〔2〕, 临床微生物学手册为≥90%^〔4〕。但本实验的分离株VP阳性率为50%, 这可能与VP实验结果判断临界点有关。本实验之所以进行阴沟肠杆菌噬菌体裂解实验, 是因为阪崎肠杆菌在1984年前属于阴沟肠杆菌, 包括参考菌株在内的22株菌, 有2株分离株能被阴沟肠杆菌噬菌体裂解, 这2株均产黄色素, API20E鉴定为阪崎肠杆菌的概率为98%, 英国先德荧光快速微生物鉴定/药敏分析仪鉴定为阪崎肠杆菌的概率> 99%。此外, 还出现尿素反应阳性和精氨酸反应阴性的阪崎肠杆菌菌株, 在对阪崎肠杆菌的鉴别中值得注意。