苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus, Bc)同属于蜡状芽孢杆菌菌群，为自然界中广泛分布的革兰阳性菌^〔1〕。其中Bt在其休眠期可形成对昆虫有毒性的伴胞晶体。因此，被作为生物杀虫剂广泛应用于农业及卫生害虫的生物防治；Bc则是人畜条件致病菌，可导致人食物中毒和感染，引起呕吐和腹泻^〔2〕。研究表明，在自然环境中，两者染色体体外遗传物质可以出现高度重组^〔3〕，在DNA水平也具有较高的同源性，只有个别碱基有差异^〔4〕。由于Bt与Bc的相似性，许多细菌分类学家认为Bt与Bc应为同一个种^〔5〕。Bt和Bc间的同源性关系，使Bt安全性问题越来越受到人们重视。因此，为研究两者的亲缘关系，对Bt的鉴定、Bt应用的安全性评价，以及进一步提高Bt杀虫效力、降低其致病风险，本文利用肠杆菌基因间重复一致序列（ERIC）-PCR技术^〔6〕对Bt和Bc全基因组DNA进行扩增，对获得的Bt和Bc基因组DNA指纹图谱进行分析，探讨Bt和Bc起源进化关系，同时筛裑⒖寺×薆t基因组DNA扩增片段，对应用ERIC-PCR技术鉴别、鉴定Bt和Bc进行可行性探讨。结果报告如下。

Bt 6株（菌株号为CGMCC 1.1749、CGMCC 1.1754、CGMCC 1.294、CGMCC 1.905、CGMCC 1.989、CGMCC 1.1014），Bc标准株1株（菌株号为CGMCC 1.126），大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等对照菌株各1株（菌株号分别为CGMCC 1.90、CGMCC 1.933和CGMCC 1.89）〔购于中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC)〕，Bc分离株2株为沈阳出入境检验检疫局分离, 并经国标生化鉴定。

(1) ERIC引物:由大连TaKaRa生物工程有限公司合成，引物序列分别为：PrimerⅠ：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′，PrimerⅡ：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；（2）试剂：Ex-Taq酶、IPTG、X-gal（大连TaKaRa生物工程有限公司）；pGEM-T vector连接转化试剂盒（pGEM-T vectorSystem Ⅱ）及JM109高效率感受态细胞（美国Promega公司）；放射性同位素[α-32P]-dCTP和随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling System，英国Biolabs公司）；尼龙膜及3MM滤纸（英国Whatman公司）；其他试剂为本实验室自配，均为分析纯。

斜面活化的菌株在LB培养基中30℃摇床培养过液(200r/min), 离心收集2ml培养的菌体(4000r/min, 10min, 20℃), 采用实验室常规酚/氯仿法提取各菌株基因组DNA。所提取DNA经Beckman DU~640检测，吸光度A260/A280值在1.8~1.9之间，纯度符合PCR扩增条件。

(1)反应体系组成和反应条件:依据文献方法^〔7〕。PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳（U=3V/cm；T=100min）。DNA标准分子量为DL2000，PCR产物经溴化乙锭(EB)染色后在凝胶成像系统上照相。

将上述扩增产物利用1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。选取重复性好的Bt基因组DNA扩增片段，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收、纯化。纯化产物连于pGEM-T载体，转入JM109感受态大肠埃希菌。连接反应、转化操作以及克隆子的鉴定按照常规方法进行；阳性克隆子用NaOH/SDS碱裂解法制备质粒DNA。

按照随机引物DNA标记试剂盒（Random Primer DNA Labeling System）说明标记回收产物，以标记产物为探针，分别与供试菌株基因组DNA进行杂交。

发生特异性杂交反应的克隆片段由大连TaKaRa生物工程有限公司进行测序。利用Primer Premier 5.0软件^〔8〕, 根据特异克隆片段序列信息设计引物，序列分别为:BthⅠ：5′-CGAGCAGTAGGCGAACCATTG-3′BthⅡ:5′-TGGCATGGGCTTTCGGATATT-3′。引物对应的扩增产物长度为363bp；PCR反应条件：94℃预变性2min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共30循环；72℃延伸5min。体系同ERICPCR。以6株Bt及其他对照菌株的染色体DNA作为模板，进行PCR反应。

图 1

1：CGMCC 1.1749；2：CGMCC 1.1754；3：CGMCC 1.2944：CGMCC 1.905；5：CGMCC 1.989；6：CGMCC 1.18467：CGMCC 1.126；8, 9：Bc分离株B：negative control-no DNAM：DL2000 图 1 Bt、Bc基因组DNA ERIC-PCR结果指纹图谱

6株苏云金芽孢杆菌和3株腊状芽孢杆菌的基因组DNA经ERIC-PCR扩增，均可产生清晰的DNA指纹图谱，扩增片段范围100~2 500bp，各菌株扩增图谱的多态性程度不同。Bt基因组DNA指纹图谱较一致，由3条主带构成，所有供试Bt菌株均有1条250bp左右的扩增片段，而蜡状芽孢杆菌间DNA指纹图谱变异较大。另外，Bt和Bc均可扩增得到600bp左右的共有片段。

图 2

1~6：Bt菌株；7, 8, 9：Bc菌株；10：枯草芽孢杆菌；11：大肠埃希菌；12：金黄色葡萄球菌 图 2 500bp探针对各菌株杂交放射性自显影1.5d照片

纯化、克隆指纹图谱中稳定出现的Bt DNA扩增片段，经DU-640测定浓度约为90μg/L，以其为探针对固定于膜上的供试菌株基因组DNA进行斑点杂交。结果显示，以500bp片段为探针，与苏云金芽孢杆菌杂交结果为阳性，枯草芽孢杆菌及属外的各菌株杂交结果为阴性。

图 3

1~6：Bt菌株；7, 8：Bc菌株；9：大肠埃希菌 图 3 引物BthⅠ和BthⅡ对Bt菌及对照菌DNA的扩增结果

根据特异克隆片段序列设计的BthⅠ和BthⅡ引物对，可以从Bt菌的基因组DNA中扩增出约360bp的片段，符合预期结果；而所有对照菌株均没有扩增条带，表明此特异片段来源于Bt菌基因组DNA。

根据本研究得到的Bt指纹图谱的保守性和Bc指纹图谱的变异性可以推测出，Bt在进化过程中出现较晚，这与Carlson等的Bt可能是获得携有cry基因质粒的Bc变种的观点相符^〔9〕。从本实验的扩增图谱中还可看出, Bt亚种tolworthi HD125与其他Bt菌株的主带型一致，这一结果与Carlson和Kolsto关于肠毒素基因阴性Bt菌株起源的观点一致，即Bc获得cry基因后，进化为肠毒素基因阳性Bt菌株，然后失去该基因进化为肠毒素基因阴性Bt菌株^〔10〕。另外，Bt与Bc均可扩增产生600bp左右的共有DNA片段，体现了二者在遗传上的高度同源性。因此，ERIC指纹图谱可以正确反映出Bt与Bc的亲缘关系。由于Bt和Bc间的同源性关系，Bt安全性问题越来越受到人们重视^{〔11, 12〕}。本研究筛选到的500bp片段可作为苏云金芽孢杆菌的鉴定用探针。