D-半乳糖衰老机制是指在一定时间内, 给动物连续注射大剂量的D-半乳糖, 使机体细胞内半乳糖浓度增高。在醛糖还原酶的催化下, 还原成半乳糖, 该物质不能被细胞进一步代谢而堆积在细胞内, 影响细胞的正常生理代谢, 导致机体衰老^〔1〕。衰老过程常会伴随着老年性骨质疏松症的发生, 因此, 利用致衰老模型探索致老年性骨质疏松症发病机制具有一定的研究价值。虾青素是一种非维生素A原的羟酮式类胡萝卜素, 广泛存在于自然界的海洋动物体、藻体及少数陆生植物体内并具有多种生物学功能, 其中尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用明显^〔2〕。本实验旨在通过虾青素对骨质常参数如骨密度、骨结构力学参数、生物力学参数、主要骨矿物质(钙、镁、锰、磷)、血清磷钙、羟脯氨酸含量及碱性磷酸酶活性等来研究此类化合物对D-半乳糖致衰老大鼠骨质的影响。

Labconco冰冻真空干燥仪(法国乐高公司); 752分光光度计、AE100电子天平(中国伯乐公司); 电热三用水箱、KA-1000型台式离心机(中国杭州华亭公司); 960型荧光分光光度计、J2-SH高速冰冻离心机、Lunar-XR型双能X线骨密度测定仪、岛津万能实验机、火焰原子吸收分光光度计(日本岛津公司); C30柱(YMC Carotenoid S-5, Waters)高效液相色谱(HPLC) (Waters 600 E溶剂输送系统, PDA-2996二极管阵列检测器Waters), 丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)测定度剂盒(南京建成生物工程研究所); 虾青素乳化剂(瑞士罗氏公司); 乙腈、甲醇、甲基叔丁基醚(MTBE) (美国迪马公司); 无水乙醇(北京化学试剂公司); 大孔吸附树脂(天津农业股份公司)。

称取10 g乳化颗粒, 加入300 ml丙酮-正己烷萃取。将脂溶性相收集, 再进行浓缩处理。

(1)装柱:将活化好的氧化铝装填于玻璃层析柱中, 用正己烷润湿。(2)洗脱:分别取2 ml虾青素提取液上柱, 用50 ml正己烷-丙酮淋洗, 收集洗脱液。将洗脱液用氮气吹干制粉备用。

根据其高效液相色谱(HPLC)中保留时间和紫外可见吸收光谱的特征峰与标准品对照进行鉴定。

6周龄Wistar雄性大鼠45只随机分为3组, 即致衰老模型组、青年对照组和虾青素组, 每组15只, 另购16月龄同品系大鼠15只作为正常老龄对照组。致衰老模型组和虾青素组每天用1.5 g/ (kg·bw)的D-半乳糖颈背部皮下注射, 剂量为0.1 ml/ 10 g, 其中虾青素组每天每只以0.2 ml灌喂20 mg / (kg·bw), 所用虾青素由本实验室提供。青年对照组注射等量的生理盐水, 每天1次, 连续注射5个月, 自由进食进水。实验结束时称量鼠的体重并取各组大鼠, 称重后乙醚麻醉, 暴露腹部, 下腔静脉取血, 待测血清中MDA含量、血清钙、血清磷、血清碱性磷酸酶(ALP), 血中SOD活性; 分离各组大鼠的双侧股骨, 测定骨长度、骨质量、骨密度、骨结构及生物力学指标; 骨中钙、磷、锰、镁、羟脯氨酸含量和骨中ALP活性。

MDA含量测定硫代巴比妥酸(TBA)比色法; SOD活性测定采用亚硝酸盐法。

血清ALP活性采用氨基氨替比啉测酚法测定; 血清钙用乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法; 血清磷采用孔雀绿微量比色法; 骨中ALP采用化学免疫法试剂盒测定(中国科学院生物物理所中生公司)。

取股骨解冻后置于骨密度测定仪上, 分近段、骨中段、远段3部分测其骨密度。近段和远段代表松质骨骨密度, 骨中段代表皮质骨骨密度。测定参数:扫描宽度20 nm, 扫描速度7 mm/ s。

取大鼠左股骨, 用千分尺测量右侧股骨的长度; 用分析天平称量两侧股骨的重量; 将股骨标本进行3点弯曲实验, 得到载荷-挠度曲线。由此曲线可直接得出大鼠骨的结构力学参数(最大载荷、最大挠度、弹性载荷、弹性挠度)。测定参数为:下压速度10 mm/ min; 下压幅度4 mm; 保持时间5 s; 跨度22 mm。断骨后, 取股骨中部作径向切片, 在显微镜下用显微尽测量股骨的最大外径A、最小外径B、最大内径a、最小内径b。并计算出大鼠股骨的各项生物力学指标。

取大鼠右侧股骨近端称重, 研碎。然后进行灰化2 h。取出骨灰, 硝酸溶解。经处理后, 火焰原子吸收分光光度计测定钙、锰、镁的含量。

取大鼠右侧股骨近端称重, 研碎。然后进行灰化2 h。取出骨灰, 硫酸溶解。经处理后, 用钼蓝显色定磷法于660 nm波长下测定。

取大鼠右侧股骨上端称重, 研碎。用3 ml氯仿-甲醇处理2 h, 过滤。再用乙醇水和丙酮冲洗1次, 放入烤箱2 h。取出后放入1 ml 12 mol/ l的HCl水解2 h, 取出后处理用氯胺T法于560 nm波长下测定。

采用SPSS 11.0统计软件进行齐性检验并作方差分析。

有机试剂的反复提取后, 通过柱层析洗脱后可以得到高纯度的虾青素提取物, 经HPLC及其光谱特征峰鉴定为反式虾青素单体。

表 1

表 1 血清MDA含量和血液SOD活性(x±s, n=15)

表 1 血清MDA含量和血液SOD活性(x±s, n=15)

与青年对照相比, 致衰老模型组血清MDA含量升高, 而血液SOD活性均有所降低, 与正常老龄对照组变化趋势一致, 说明D-半乳糖大鼠衰老模型建立成功。而虾青素组与致衰老模型组比较, 血清MDA含量升高, 血液SOD活性降低, 且差异有统计学意义(P < 0.01)。

表 2

表 2 股骨结构力学、生物力学指标(x±s, n=15)

表 2 股骨结构力学、生物力学指标(x±s, n=15)

与青年对照组比较, 正常老龄对照组在股骨重量、长度明显增加, 而致衰老模型组2项指标明显减少。而在股骨密度、结构力学和生物力学指标方面表明, 正常老龄对照组和致衰老模型组与青年对照组比较, 差异有统计学意义(P < 0.05)。正常情况下随年龄的增长, 大鼠股骨长度和重量都会相应增加, 同时由于各种内外因素其股骨的结构力学和生物力学将呈现下降趋势。实验结果表明, 注射D-半乳糖5个月可以达到改变股骨结构力学和生物力学的指标, 且作用与正常老龄大鼠变化趋势一致, 证明在建立D-半乳糖致衰老模型的同时, 也可以导致老年性骨质疏松症的可能。而虾青素组与致衰老模型组比较, 骨密度、结构力学和生物力学参数指标均有所升高, 且差异有统计学意义(P < 0.05)。

表 3

表 3 骨矿物质含量、血钙磷及ALP活性测定(x±s, n=15)

表 3 骨矿物质含量、血钙磷及ALP活性测定(x±s, n=15)

与青年对照组比较, 致衰老模型组和正常老龄对照组骨钙、锰、镁及血磷含量均明显减少, 差异有统计学意义(P < 0.01), 表明注射D-半乳糖的大鼠骨中几种重要的矿物质含量比同龄正常大鼠有所降低, 而与正常老龄对照组的骨矿物质含量变化趋势一致。再次证明长期服用D-半乳糖可以导致老年性骨质疏松症的可能。而虾青素组与致衰老模型组相比, 骨钙、锰、鲜及血磷含量均明显升高, 且差异有统计学意义(P < 0.01)。与青年对照组比较, 致衰老模型组和正常老龄对照组骨中羟脯氨酸含量均明显减少, 差异有统计学意义(P < 0.01)。致衰老模型组血清ALP和骨ALP活性与青年对照组比较显著升高; 致衰老模型组与正常老龄对照组血清ALP活性比较也有所升高, 2组变化趋势一致。而虾青素组与致衰老模型组比较, 羟脯氨酸含量明显升高, 血清ALP和骨ALP活性较明显降低, 且差异有统计学意义(P < 0.01)。

研究表明, 大量的活性氧摄入会从整体、细胞和基因不同水平层次上影响骨的代谢过程^{〔3, 4〕}。当大量进食D-半乳糖会产生过多的自由基, 在骨重建中, 自由基可以破坏胶原蛋白形成, 导致骨中矿物质沉积减少, 从而造成钙、磷、镁、锰等元素的流失, 影响骨密度, 抑制骨的形成, 造成老年骨质疏松^{〔5, 6〕}。同时胶原蛋白加速分解生成羟脯氨酸并随血、尿流失, 且随年龄而增加, 使得骨中两者的含量均相应减少。另外由于骨基质结构建成受阻, 同时矿物质含量下降, 从而使骨的结构力学和生物力学受到了影响, 大大降低了骨的抗变性能力, 提高了发生骨折的机率。研究发现, 虾青素可以有效地缓解增强成骨细胞增殖和分化, 同时对局部细胞因子(如ALP酶、iv型胶原蛋白等)具有上调作用, 表明虾青素可能参与骨代谢有关调节活动, 再加上其极强的抗氧化能力, 或许对致衰老性骨质疏松症具有一定预防或辅助治疗意义^{〔7, 8〕}。本实验中青年对照组血清ALP活性低于致衰老模型组和正常老龄对照组, 而致衰老模型组又高于正常老龄对照组, 这可能是由于晚期糖化终末产物(AGEs)浓度增加, 使破骨过程显著增强, 成骨过程继发增加, 骨代谢处于一种高转变状态, 成骨细胞的活跃造成血ALP活性增加。综上所述, 本实验通过有关骨质疏松症的相关指标检验, 证实D-半乳糖诱导衰老大鼠过程的同时, 可能诱发致衰老性骨质疏松。而虾青素可有效地缓解此类致衰老性骨质变化。