精神分裂症是一种最常见的病因未明的精神疾病, 具有明显的遗传倾向, 遗传因素在其发病过程中起主导作用, 但其遗传机制目前尚未完全阐明^〔1〕。定位和克隆精神分裂症易感基因, 不仅有助于阐明其分子遗传学机制, 同时也为临床基因诊断、基因治疗和药物设计奠定基础。因此, 易感基因的研究一直是精神分裂症病因学研究的重点。其中, 生长因子基因及与其相关的细胞信号传导通路已经成为精神分裂症易感基因研究的热点。PI3 K/PKB (Akt)信号传导通路在精神分裂症的发生发展中起着重要的作用, 其活性的减退很可能是精神分裂症发生的病理生理学机制之一^〔2〕。第二信使PIP3是该信号传导通路上至关重要的分子^〔3〕。本研究旨在探讨6号染色体长臂2区5带上编码PIP3的PIP3-E基因多态性与精神分裂症的关系。

2000~2005年吉林省四平市精神病医院和长春市凯旋医院经临床诊断(符合国际疾病分类标准第10版精神分裂症诊断标准, ICD-10), 参照《中国精神病分类与诊断标准方案》(第2版)修订本精神分裂症诊断标准(CCMD-2-R)确诊为精神分裂症的患者。共102个核心家系(患者及其健康父母), 均为中国北方汉族人。患者中男性72人, 女性30人, 平均年龄为(25.61±6.58)岁。在获得知情同意后取外周静脉血5 ml (肝素抗凝), -20 ℃保存至提取基因组DNA。

采用计算机国际互联网(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP), 在人类基因组库中对PIP3-E基因上的SNPs进行检索, 选出4个SNPs, 根据引物设计原则设计4对特异性引物。序列如下: SNP1 : F : 5′-AGAACTCACAGAAGCAGCCCTA-3′, R : 5′-GCAGGGTTTGTGAATAGCTTTG-3′; SNP2 : F : 5′-GGAAGCTGGAAAATGACCTAAA-3′, R : 5′-GGCATTTATTTGTTCAGCCTTC-3′; SNP3 : F :5′-CTGGCCCAGCTACAATAATTT-3′, R : 5′-TGTTAACACCTAATGGGCTGA-3′; SNP4 : F : 5′-TGACTATCTGAATCAGCCGAAA-3′, R : 5′-CCAGCAGTGTTTGAGAATGACT-3′。

采用Promega液体纯化提取DNA试剂盒(美国Promega公司), 严格按照说明书方法与步骤提取外周血白细胞中的基因组DNA。

用PCR-RFLP方法进行基因型检测。PCR反应体系为25 μl, 含有H₂O (二馏灭菌水) 18.6 μl; 10 × Buffer 2.5 μl; dNTP (10 mmol/ml) 0.7 μl; Primer : F (30 pmol/μl) 0.25 μl, R (30 pmol/μl) 0.25 μl; Taq E (5U/μl)0.7 μl; DNA (20~30 ng/μl) 2 μl。PCR反应条件:95 ℃、5 min, 94 ℃、45 s, 62 ℃、55 s, 72 ℃、40 s, 5个循环; 94 ℃、45 s, 61 ℃、55 s, 72 ℃、40 s, 5个循环; 94 ℃、45 s, 60 ℃、55 s, 72 ℃、40 s, 30个循环; 72 ℃延伸10 min。限制性酶切PCR扩增产物:应用HindⅢ, HaeⅢ, BglⅡ和ApaⅠ限制性内切酶分别对SNP1, SNP2, SNP3和SNP4的PCR产物进行酶切, 在37 ℃恒温箱中闭盖进行酶切4 h。酶切产物用2.5 %琼脂糖凝胶, 90 V电压电泳50 min, 溴化乙锭染色, 应用Jel Doc2001型凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)观察酶切产物, 并根据产物片断大小确定基因型, 即切开纯合型(1/ 1)、未切开纯合型(2/ 2)及杂合切开型(1/ 2)。

采用拟合优度χ²检验, 计算基因型频数分布是否符合Hardy-Weinberg平衡。采用SPSS 12.0统计分析软件进行传递不平衡检验(TDT)、单倍体相对风险分析法(HRR)和χ²检验, 分析PIP3-E基因上4个SNP位点多态性与精神分裂症及其临床症状之间的关系。

检验结果表明, 基因型频数分布无论在父母组还是在患者组均符合Hardy-Weinberg平衡(P均 > 0.05)。

表 1

表 1 PIP3-E基因与精神分裂症的TDT和HRR分析

表 1 PIP3-E基因与精神分裂症的TDT和HRR分析

(1)传递不平衡检验(TDT) :结果显示, PIP3-E基因上4个SNPs杂合子父母传递给受累子女的等位基因均未偏离50 %(P > 0.05), 表明上述位点与精神分裂症无关联。(2)单倍体相对风险分析(HRR) :结果显示, PIP3-E基因上4个SNPs的等位基因在患者组和父母组的频数分布差异均无统计学意义(P > 0.05), 表明上述位点与精神分裂症无关联。

表 2

表 2 PIP3-E上各等位基因与精神分裂症临床症状的关联分析

表 2 PIP3-E上各等位基因与精神分裂症临床症状的关联分析

针对精神分裂症的某一临床症状可将病人分为有或无该症状2组, 分析每个SNP位点等位基因及基因型在2组间的分布差异是否有统计学意义, 从而说明该位点与精神分裂症之间的关系。各位点等位基因与临床症状的关联性分析结果表明:rs2236257位点(SNP1)与关系妄想、自责自罪妄想以及思维连贯性障碍相关联(P < 0.05)。

本文TDT和HRR分析结果提示, PTP3-E基因多态性与精神分裂症无关联。精神分裂症是一种复杂多基因疾病, 一般认为其发生是多个微效基因协同作用的结果, 由于它们各自发挥较小的作用而很难被检测。同时, 不同家庭、种族、地区和人群存在遗传异质性, 这些因素常常降低检测疾病和某一特异SNP标记之间关联研究的统计效力^〔5〕。因此, 本研究进一步进行了SNPs位点与精神分裂症临床症状关联性的分析。分析结果显示:rs2236257 (SNP1)位点等位基因与关系妄想、自责自罪妄想以及思维连贯性障碍相关联(P < 0.05), 该结果提示其遗传异质性可能影响精神分裂症的临床表现型, 其机制有待进一步探讨。精神分裂症的遗传学研究是一项复杂而长期的工作, 虽然本研究中获得了部分阳性结果, 但尚不能确定其在精神分裂症发病机制中的作用, 仍需进一步扩大样本量并进行多位点SNPs研究以进行深入的探讨。