贵州野生多汁乳菇, 又名奶浆菌, 盛产在贵州山区, 富含人体必需氨基酸及常量、微量元素^〔1〕, 贵州野生多汁乳菇具有明显抗辐射作用^〔2〕。蘑菇类提取的多糖具有增强机体免疫力、抗辐射、抗肿瘤、抗疲劳等多方面的生物学活性^{〔3, 4〕}。本文对野生多汁乳菇改善机体免疫功能的作用进行了研究。

市场上购得批次鲜品, 测定鲜品平均水份为89.3 %, 去泥、洗净, 在55~60 ℃烘箱内烘干, 粉碎, 过25目筛, 置干燥器内保存备用。称取一定量的多汁乳菇干品, 加适量蒸馏水, 煮沸3次, 每次0.5 h, 合并3次滤液, 80 ℃水浴浓缩, 定容备用。

清洁级雌性昆明种小鼠(贵阳医学院实验动物中心)〔合格证号SCXK (黔)2002-0001〕, 体重18~22 g, 小鼠饲料、绵羊红细胞、制备补体用的豚鼠。饲养环境为贵州省疾病预防控制中心洁净动物实验室(合格证号SYXK (黔)2003-0003)。

据动物体重随机分组, 用雌性小鼠80只, 分为4组, 每组动物20只。设为: (1)正常对照组; (2)多汁乳菇组9 g/(kg· bw); (3)多汁乳菇9 g/(kg· bw) +环磷酰胺(CP) 50 mg/(kg · bw)组; (4)环磷酰胺(CP) 50 mg/(kg· bw)组。每日上午9 :00灌胃; (2)、(3)组给多汁乳菇提取物; (1)、(4)组灌胃等容积的蒸馏水, 连续35 d。(3)、(4)组在开始实验时, 每天腹腔注射环磷酰胺50 mg/(kg· bw), 连续7 d, 实验结束前5 d, (3)、(4)组小鼠再腹腔注射环磷酰胺100 mg/(kg· bw)一次。

(1)动物体重变化:观察动物的一般表现, 每周称体重1次。(2)免疫器官及脏体系数:试验结束称体重后, 处死小鼠, 摘取胸腺和脾脏, 称重, 计算脏体系数。(3)碳粒廓清试验:试验结束时, 小鼠左内眦静脉丛注射33 %的印度墨水20 ml/(kg· bw), 于注射后1~10 min, 分别从右内眦静脉丛取血20 μl, 放入2 ml 2 %Na₂CO₃溶液中, 测定2次的吸光度(A)值, 用吞噬指数α(α代表小鼠碳廓清的能力)表示。α=体重/(肝重+脾重) × , K=(1gA₁ -lgA₂) / (t₂-t₁), t₁、t₂代表注射墨汁后的2次取血时间。(4)血清抗绵羊红细胞(SRBC)抗体测定(HC₅₀) :用2%SRBC腹腔免疫小鼠4 d后, 眼内眦静脉取血, 分离血清, 测定血清抗体水平, 以半数溶血值(HC₅₀)表示, HC₅₀=样品吸光度值/SRBC半数溶血时的吸光度值×稀释倍数。(5)迟发性变态反应(DTH) :用2 %SRBC腹腔免疫小鼠后第4 d, 在其左后趾部皮内注射20%SRBC, 注射后24 h测定足趾部厚度, 以攻击前后足趾厚度差值(mm)表示。

采用SPSS 11.0软件进行方差分析。

在实验期间, 腹腔注射CP的小鼠在实验开始3 d后, 表现为精神不振、呆卧、竖毛、少食, 实验到14 d后, 小鼠基本恢复正常。正常对照组和多汁乳菇组小鼠体重变化从0~4周生长体重呈增加趋势, 至第4周小鼠平均体重基本相等; 多汁乳菇+ CP组从0~4周体重呈增加趋势, 第4周时平均体重低于正常对照组; CP组小鼠在第2周时平均体重低于第1周, 以后呈增加趋势, 第4周时平均体重低于正常对照组。

表 1

表 1 各实验组小鼠脏器系数(x±s, n=20, mg/g)

表 1 各实验组小鼠脏器系数(x±s, n=20, mg/g)

CP组的胸腺指数较正常对照组明显降低(P < 0.01), 说明用CP免疫小鼠, 使模型组的胸腺明显萎缩, 免疫功能下降, 在给CP的同时给予9 g/(kg· bw)多汁乳菇后, 该组的胸腺指数明显高于CP组, 提示多汁乳菇能促进小鼠胸腺的生长发育, 增强免疫力。多汁乳菇+ CP组和CP组的脾脏系数由正常的4.30 mg/g上升至9.82和7.67 mg/g, 明显高于正常对照组(P < 0.01), 这可能与本次实验建立的免疫缺陷模型的方式有关。

表 2

表 2 各实验组小鼠的免疫指标(x±s, n=10)

表 2 各实验组小鼠的免疫指标(x±s, n=10)

利用SRBC免疫小鼠后, 产生抗SRBC抗体(溶血体), 与SRBC一起孵育, 在补体参与下可发生溶血反应, 通过测定Hb含量反映血清溶血素的含量。昆明种小鼠在受CP损伤后, 血清HC₅₀明显下降, 但在同时给9 g/(kg· bw)的多汁乳菇后, HC₅₀明显升高(P < 0.01), 但仍明显低于正常对照组(P < 0.01)。提示多汁乳菇能增强免疫损伤小鼠的体液免疫功能, 但不能使之恢复到正常水平。

CP + 9 g/(kg· bw)的多汁乳菇组明显提高小鼠足趾厚度差值(P < 0.01), 且与正常对照组比较差异无统计学意义。提示多汁乳菇能增强免疫损伤小鼠的细胞免疫功能, 并使之恢复到正常水平。

碳粒廓清指数表示在一定范围内, 小鼠清除进入机体碳粒的速率, 是非特异性免疫功能的1个指标。CP + 9 g/(kg· bw)的多汁乳菇组明显提高小鼠的碳粒廓清速率(P < 0.01), 且与正常对照组差异无统计学意义。提示多汁乳菇能明显改善免疫损伤小鼠的非特异免疫功能, 并使之恢复到正常水平。

本次实验小鼠在开始实验时腹腔注射CP50 mg/(kg· bw) 7d, 在实验结束前5 d, 再腹腔注射一次CP100 mg/(kg· bw)后, 小鼠的体液免疫、细胞免疫和非特异性免疫功能指标均比正常对照组明显降低, 说明免疫受损模型是成功的。在机体免疫系统受损的同时给野生多汁乳菇提取液9 mg/(kg· bw) 35 d后, 血清溶血素、DTH、碳粒廓清指数、胸腺指数较CP组都有明显提高, 其中DTH、碳粒廓清指数α恢复至正常水平。这提示多汁乳菇对细胞免疫功能和非特异性免疫功能有较好的保护作用。血清溶血素水平多汁乳菇+ CP组明显高于CP组, 但未恢复至正常水平。这可能是因为体液免疫功能对免疫损伤较敏感。体液免疫功能恢复需要具有分泌抗体能力B淋巴细胞的恢复才能体现, 这导致小鼠体液免疫系统免疫损伤的恢复时间较长。本次实验结果表明, 多汁乳菇具有明显改善受损机体免疫功能的作用, 但其具体的功效成分、作用强度及最佳生物学效应还有待进一步研究。