流行病学和动物实验已证实, 镍化合物可以致癌, 以致肺癌为主。为进一步研究Cap43在镍所特异引起肺癌者体内组织及血清中的表达水平及其特点, 本实验采用硫化二亚胺(EDC)连接多肽与大分子载体蛋白的方法, 使其组成完全抗原, 进而免家兔制备抗Cap43多克隆抗体, 为研究镍所致肺癌提供依据。

多肽由上海生工全自动合成仪合成; EDC试剂盒(美国Pierce公司), 完全及不完全福氏佐剂(美国Sigma公司); HRP-羊抗兔和DAB (北京中杉金桥生物技术公司); 硝纤维素膜(NC膜), Sephadex^TMG-25脱盐柱(Amersham Biosciences, Sweden), 小牛血清, 牛血清白蛋白(洛阳华美公司); loading buffer (北京碧云天生物公司); 其他试均为国产分析纯; 日本大耳兔平均体重1.5 kg (本校动物实验中心)。

由上海生工合成Cap43 C末端特征性的由10个氨基酸(TRSRSHTSEG)重复3次所组成的肽段。总质量为10 mg, 合成后期经HPLC纯化, 纯度> 95%。冷冻干燥4℃保存。

(1)正式实验之前的动物准备:取5只体重1.5kg的雄性家兔作为免疫动物, 同时抽取免疫前的动物血清作为阴性对照。(2)用EDC法将半抗原与载体蛋白(mcKLH)连接成同时具有免疫原性与免疫反应性的大分子量完全抗原, 反应过程严格按照EDC试剂盒的说明书进行。(3)使用脱盐柱脱盐, 纯化大分子载体蛋白-多肽连接物:分别用10个1.5 ml的EP管依次收集10管流出液, 紫外分光检测波长280 nm处各管的吸光度(A)值, 如果在280 nm波长处有1个显著的吸收峰, 表示连接成功。(4)将连接好的半抗原-载体蛋白混合物与等体积佐剂的混合, 采用常规微量多次免疫法免疫家兔(抗原0.5 mg/只), 第1次免疫使用完全福式佐剂, 并于4周后进行第2次免疫(第2次及以后使用不完全福氏佐剂), 以后每2周免疫1次, 于第5次免疫后1周采耳缘静脉血, 间接斑点ELISA法检测抗体的效价, 达到一定效价后直视下心脏采血收集血清。

取硝酸纤维素膜(NC膜)制成4 cm × 4 cm的方格, 浸入0.1 mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)中10 min, 室温干燥后, 将卵清蛋白(OVA)-半抗原(连接方法与上述半抗原-mcKLH相同) PBS液每格1μl包被NC膜, 室温静置1 h; 2%的牛血清白蛋白溶液封闭, 室温振荡1 h; 0.5 % Tween 20的PBS液洗3次, 室温干燥; 加一抗, 同时设立阴性对照即免疫前小兔的血清, 其与一抗稀释度相同, 空白对照即0.01 mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS), 每格1μl, 室温静置1 h后用洗涤液洗3次, 室温干燥; 加酶标二抗每格1μl, 室温静置0.5 h后用洗涤液洗3次, 5 min/次, 室温干燥; 每格加入适量底物DAB显色液, 避光显色5~10 min, 蒸馏水冲洗中止反应, 目测观察^〔1〕。

取需纯化的血清用60 mmol/L, pH4.0醋酸缓冲液稀释4倍(0.1 mol/L的HCl调pH 4.5);于室温搅拌下在30 min内逐滴加入辛酸, 按每毫升稀释前的血清体积加75μl, 4℃静置2 h, 15 000 r/min离心30 min, 弃沉淀; 上清滤纸过滤后加1/10体积的pH 7.4, 0.1 mol/L PBS (用1 mol/L的NaOH调pH至7.4);在4℃冰浴下于30 min内加入0.277 g/ml硫酸铵, 使成45%饱和度, 4℃静置过夜, 12 000 r/min, 离心30 min, 弃上清; 沉淀溶于适量0.01 mol/L、pH 7.4的PBS中, 用PD10柱过滤, 收集流出液, 无菌过滤分装, -20℃保存备用。

采用12% SDS-PAGE电泳检测抗体纯度, 将电泳完后的凝胶放于溶解了0.25 g考马斯亮蓝R250的甲醇、水、冰乙酸组成的染色液中室温过夜, 之后放于脱色液中脱色, 直至凝胶底色脱为无色为止, 观察染色条带。

图 1

图 1 半抗原-载体蛋白连接实验后的A值

从图 1可见, 峰值在4, 5管, 此时收集第4, 5管即峰值所在管中的溶液。

(1)最适抗原和酶标二抗浓度的选择:测定结果为抗原为1: 20, 酶标二抗浓度为1: 320; (2)最适室温选择:室温下1 h的效果较4℃过夜效果要好; (3)最佳封闭条件:采用2%牛血清白蛋白0.01 mol/L的pH 7.4的磷酸盐缓冲液闭效果较好; (4)振荡对反应的影响:振荡可加快抗原抗体反应速度, 与在振荡条件下封闭0.5 h的效果相同; (5)血清灭活:阴性血清经灭活56℃灭活补体后假阳性反应减少。

图 2

图 2 斑点ELISA检测兔抗Cap43多克隆抗体效价

经目测, 阳性反应为棕红色斑点, 阳性显色>阴性>空白, 并且斑点颜色的深浅随血清抗体滴度的升高而变浅。最终实验结果为, 兔抗Cap43多克隆抗体效价为1: 500。

图 3

图 3 SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝鉴定初步纯化后的兔抗Cap43抗体纯度

根据蛋白分子Marker标记, 纯化后的第3条带为抗体所在位置。

研究发现, Cap43除了有磷酸化位点外, 它没有跨膜转运区域或是锌指结构以及金属结合区, 但在其C末端由10个氨基酸(T RSRSHTSEG)重复3次组成的特征性序列上可能有镍结合位点^〔2〕。pH计分光镜分析表明, 其中的20个氨基酸残基(定为肽段1)可以结合1到2个金属离子, 而30个氨基酸(定为肽段2)可以结合1个、2个或3个金属离子。分析生理条件下金属离子与其配基的比例发现, 不管是肽段1还是2可结合镍的金属离子都与其肽段中的组氨酸残基的咪唑氮原子的数量相对应。在pH 8~9之间可以形成八面体结构, 在pH 9以上可以形成平面4N的结构。同时在Cap43启动子上有1个HIF-1结合位点, 在3'末端非翻译区有2个HIF-1结合位点, 其中1个是调节转录的。研究表明, 在镍化合物及缺氧应激因素同时存在时, 可引起Cap43更高的表达; 在镍及缺氧在缺氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1, HIF-1)敲除的细胞系中则丧失了诱导Cap43表达的能力^〔3-5〕。由此可见, 肿瘤(缺氧)-镍化合物(镍)-Cap43之间一定存在某种关系。

为研究Cap43在镍所特异引起的肺癌中的分子生物学发生机制, 采用碳化二亚胺EDC化学偶联试剂盒连接合成的Cap43末端特征性的30个氨基酸组成的多肽组成的半抗原和大分子载体蛋白钥孔血蓝蛋白mcKLH制备成完全抗原(多肽-mcKLH), 使其同时具有免疫原性与免疫反应性, 以其免疫家兔, 经11周多次微量免疫后获得兔抗Cap43多克隆抗体; 采用斑点ELISA法检测抗体效价, 避免了抗原用量多与半抗原不好包被96孔板的缺点, 之后经辛酸-硫酸铵法初步纯化抗体, 辛酸-硫酸铵法方法简便, 一般实验人员容易掌握, 同时仅需冷冻高速离心机这一实验仪器, 它既可用于小样品的纯化也可用于大样品的纯化, 提取的IgG纯度高, 收率好, 且不破坏抗体的免疫功能。Cap43抗体的制备及初步纯化将有助于今后进一步研究工作。