维生素A (VA)和锌(Zn)均是机体生长发育必需的微量营养素, 但过量摄入VA和Zn对机体具有一定的损伤作用。研究发现, 两者的过量可降低脾脏的抗氧化功能, 造成脂质过氧化损伤^〔1〕。本研究通过建立初成年SD雌性大鼠VA和Zn过量摄入模型, 探讨VA过量、Zn过量、VA和Zn联合过量对初成年雌性大鼠生殖系统的影响, 从氧化应激角度探讨过量摄入VA、Zn对雌性大鼠生殖系统的可能毒性机制。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

动情周期正常的初成年健康SD雌性大鼠(SPF级) 72只, 8周龄, 体重(180±15) g, (甘肃中医学院实验动物中心, 动物证号:SCXK (甘) 2004-007)。

1.1.2 试剂

VA醋酸酯(粉剂), 纯度为32.5万 U/g (北京嘉康源化工有限公司); 硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O), 分析纯(莱阳化工实验厂); 超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

1.1.3 仪器

722型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司); SHA-B型水浴恒温振荡器(常州国华电器有限公司); TGL-6G-A型高速冷冻离心机(上海安亭化学仪器厂); 120型台式电子天平(德国赛多利斯天平有限公司)。

1.2 方法 1.2.1 剂量选择与分组

阴道涂片法连续涂片10 d, 筛检动情周期连续2次为4~5 d的初成年健康SD雌性大鼠72只, 分笼单只喂养, 喂饲营养均衡饲料, 饮双蒸水, 随机分为6组, 每组12只, 每日定时等容积(0.5 ml)灌胃给予大鼠受试物, 具体剂量^〔2〕为, 正常对照组(CG):双蒸水0.5 ml/d; Zn实验组(ZnG):累计剂量相当于大鼠20倍推荐摄入量(RNI); VA实验组(VAG):累计剂量相当于大鼠30倍RNI; VA和Zn联合实验Ⅰ组[(VA+Zn)ⅠG]:VA和Zn累计剂量分别相当于大鼠10倍、20倍RNI; VA和Zn联合实验Ⅱ组[(VA+Zn)ⅡG]: VA和Zn累计剂量分别相当于大鼠30倍、20倍RNI; VA和Zn联合实验Ⅲ组, [(VA+Zn)ⅢG]:VA和Zn累计剂量分别相当于大鼠50倍、20倍RNI, 1次/d, 连续30 d, 期间正常喂饲双蒸水, 每隔3 d称重1次。

1.2.2 卵巢组织匀浆制备

于染毒第31 d处死大鼠, 分离血清, 卵巢称重后剪碎, 用玻璃匀浆器加入0.01 mmol/L TrisHCl缓冲液[0.01 mol/L蔗糖、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)]制成10% (m/v)组织匀浆, 5000 r/min离心10 min, 取上清液待测。

1.2.3 指标测定

血清和卵巢组织中SOD、GSH-Px活性、T-AOC、MDA含量的测定依据试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行, 卵巢组织蛋白以总蛋白浓度来校正。

1.3 统计分析

采用SPSS 11.5软件进行单因素方差分析, 并进行对照组与实验组的两两比较。

2 结果 2.1 VA和Zn摄入对SOD、GSH-Px活性的影响

在卵巢组织中, 各实验组SOD、GSH-Px活性与CG比较明显降低各实验组与CG比较, 差异均有统计学意义, (P < 0.01); (VA +Zn)ⅡG与ZnG比较GSH-Px活性降低(P < 0.05); (VA +Zn)ⅡG与VAG比较GSH-Px活性降低(P < 0.05); (VA +Zn)ⅡG与(VA+Zn)ⅢG比较GSH-Px活性降低(P < 0.05)。在血清中, 各实验组SOD活性与CG比较, 除ZnG降低外, 其余各实验组均升高, 但差异无统计学意义; (VA+Zn) IG与ZnG比较SOD活性升高(P < 0.05), 各实验组GSHPx活性与CG比较, 除ZnG、(VA+Zn) IG降低外, 其余各实验组均升高, 但差异无统计学意义; (VA+Zn)ⅢG与ZnG比较GSH-Px活性升高(P < 0.05), 见表 1。

2.2 VA和Zn摄入对T-AOC活力、MDA含量的影响

在卵巢组织中, 各实验组T-AOC活力与CG比较明显降低(各实验组与CG比较, 差异均有统计学意义, P < 0.01, 其中(VA+ Zn) IG和ZnG与CG比较, P < 0.05;各实验组MDA含量与CG比较, 除ZnG与VAG升高外, 其余各联合实验组均降低, 但差异无统计学意义; (VA+Zn)IG与ZnG比较, MDA含量降低(P < 0.05); (VA+Zn)ⅢG与ZnG比较, MDA含量降低(P < 0.05)。在血清中, 各实验组T-AOC活力与CG比较降低, (VA+Zn)ⅡG和(VA+Zn)ⅢG与CG比较, 差异有统计学意义, P < 0.05, 各实验组MDA含量与CG比较均降低; (VA+ Zn)ⅢG与CG比较, 差异有统计学意义(P < 0.05); (VA+Zn)ⅢG与(VA+Zn)IG比较, MDA含量降低P < 0.05, 见表 2。

3 讨论

摄入大剂量VA可引起急性、慢性及致畸毒性^{〔3, 4〕}, 过量摄入Zn可以损害免疫器官和免疫功能^{〔5, 6〕}, VA和Zn具有某些相似的生理功能, 可能具有协同效应^{〔7, 8〕}。本研究观察到过量摄入VA、Zn能引起大鼠卵巢的氧化应激。

SOD与GSH-Px作为酶系和非酶系自由基清除剂, 对维持机体抗氧化能力稳定起关键作用, 各实验组卵巢组织中SOD活性、GSH-Px含量有不同程度降低, 说明过量摄入VA、Zn可抑制SOD活性, 使GSH-Px含量减少, 破坏机体氧化平衡状态, 从而使细胞抗氧化应激能力下降, 而氧化应激会进一步引起脂质过氧化、巯基耗竭等氧化性损伤。T-AOC是机体防御体系之一, 其能力强弱与健康程度存在着密切联系, 该体系有酶促和非酶促2个体系, 这种机能的降低常常导致各种疾病的产生, 而过量摄入VA、Zn所致的各实验组卵巢组织中T-AOC的降低, 更进一步证实过量VA、Zn所致脂质过氧化损伤作用加剧。在本实验研究剂量下, 过量摄入VA、Zn对大鼠卵巢功能已产生一定的影响, 引起卵巢组织的氧化损伤, 表现在抗氧化系统活性降低, M DA增加, 由此调节卵巢抗氧化系统的活性, 这可能是过量摄入VA和Zn对生殖系统损伤的毒理机制之一。