银杏具有重要药用价值, 已知其化学提取物多达160余种。主要有黄酮类、萜类、酚类、生物碱、聚异戊烯、奎宁酸、亚油酸、蟒草酸、抗坏血酸、α-已烯醛、白果醇、白果酮等。其中成药制品可以防治高血压、心脑血管等疾病, 对延缓衰老具有特殊的功效^{〔1, 2〕}。本文研究银杏滴丸对快速老化鼠超氧化物歧化酶(SOD)基因和蛋白表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法 1.1 样品

银杏滴丸为黑褐色小颗粒(某制药股份有限公司)。

1.2 试剂

聚赖氨酸(美国Sig ma公司); 山羊抗大鼠SOD多克隆抗体(美国SANTA CRUZ公司); 丙二醛(MDA)测定试剂盒、SOD活性测定试剂盒、考马斯亮兰蛋白测定试剂盒(中国TBD生物技术发展中心)。RT-PCR反应试剂盒(美国Promega公司)。免疫组化二抗试剂盒二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 仪器

DY Y-38B型电泳槽(北京六一仪器厂); 日立20R P52D高速冷冻离心机; 平推切片机(德国LEICA公司); 病理图象分析显微镜(日本Olympus公司); 恒温水浴震荡器(美国Lab Line公司); GeneAmp ^®PCR System 9700PCR反应仪; Image Master ^®VDS Pharmacia Biotech光密度分析仪。

1.4 动物与分组

采用6月龄快速老化鼠(SAM-P/8)。(天津市中医学院附属第一医院), 3级(SPF)级实验动物房饲养。试验分快速老化鼠对照组和快速老化鼠干预组2组, 每组10只, 银杏滴丸人体推荐摄入量为0.60 g/(60kg·bw)。根据预试验结果, 选择受试剂量为0.05 g/(kg·bw)即相当于人体摄入量的5倍。受试物用蒸馏水配制成溶液, 对照组给予等量蒸馏水, 经口灌胃2个月, 灌胃量0.2 ml/(10g·bw)。处理完成后迅速处死小鼠取肝组织测定以下指标。

1.5 SOD活性、MDA含量测定

将肝组织0.3 g匀浆, 3000 r/min离心取上清测定。MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法, SOD活性测定采用黄嘌呤氧化法, 按照试剂盒说明书。

1.6 免疫组化方法

用链霉卵白素抗生素蛋白-过氧化物酶连结法(SP法)对肝脏标本石蜡切片进行免疫组化染色, 检测SOD蛋白在肝组织的表达。一抗为山羊抗小鼠SOD多克隆抗体, 浓度均为1:200, 生物素化兔抗山羊二抗, 以磷酸盐缓冲液(PBS)为一抗作阴性对照。细胞浆着棕黄色判定为阳性细胞。

1.7 RT-PCR方法

取肝组织采用改进的异硫氰酸胍酚-氯仿RNA快速提取法提取总RNA。260和280 nm处测定RNA吸光度(A)值, 评估纯度并计算其浓度。SOD上游引物5'-CCACTGCAGGACCTCATT-3', 下游引物5'-CAAGCGGCTTCCAGCATT-3', 所扩增的小鼠Cu-Zn SOD特异性基因片断应为260 bps。小鼠3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)上游引物5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3', 下游引物5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3', 所扩增的小鼠GAPDH特异性基因片断应为452 bp。RT-PCR按下列顺序加样:无核酸酶水26.4 μl; AMV/Tf15×反应缓冲液10 μl; dNTPMix (10 mmol/Leach dNTP) 1 μl; 上游引物50 pmol; 下游引物50 pmol; 25 mmol/L MgSO₄2 μl:AMV反转录酶1 μl; Tfl DNA聚合酶1 μl; RNA样品2 μl; 终体积50 μl。试验条件为:42℃ 60 min, 94℃ 3 min:变性94℃ 1 min, 退火60℃ 1 min, 延伸72℃ 1 min, 循环30次, 72℃ 4 min, 4℃反应完成后, 产物于-20℃保存; RT-PCR产物电泳检测、吸光度扫描分析。

1.8 统计分析

采用SPSS 11.0软件进行方差分析, 对方差不齐的数据, 适当变量转换后进行统计, 变量转换后仍未达到方差齐, 用非参数检验进行分析。

2 结 果 2.1 银杏滴丸对小鼠MDA、SOD的影响(表 1)

经口给予银杏滴丸后, 快速老化鼠干预组肝匀浆中MDA含量低于其对照组, 且差异有统计学意义(P < 0.15), SOD活性高于对照组, 且差异有统计学意义(P < 0.15)。

2.2 银杏滴丸干预后快速老化鼠SOD基因表达与其对照小鼠比较(图 1)

由图 1可见, 给予银杏滴丸干预后, 快速老化鼠SOD mRNA的RT-PCR产物电泳条带亮度明显增强, 表明银杏滴丸可以引起快速老化鼠 SOD 基因表达增加。

2.3 免疫组织化学检测银杏滴丸干预后快速老化鼠SOD蛋白表达结果(图 2)

由图 2可见, SOD蛋白定位于肝细胞胞浆内, 给予银杏滴丸干预后, 快速老化鼠SOD蛋白表达明显增强, 表明银杏滴丸可以使快速老化鼠SOD蛋白表达增加。

3 讨论

衰老与O₂^·-、·OH及H₂O₂等活性氧密切相关^{〔3, 4〕}。银杏滴丸是由天然植物银杏叶提取而成, 其主要成分为黄酮类及银杏内脂等。本研究结果显示, 经口给予银杏滴丸后, 干预组动物肝匀浆中MDA明显低于对照组、SOD活性明显高于对照组, 表明银杏滴丸具有抗氧化作用^〔5〕。与YoshikawaT等研究银杏提取物具有保护细胞膜结构和功能的完整性, 抑制缺血时自由基产生, 对抗细胞膜脂质过氧化所引起的病理过程和衰老过程的结果一致^〔6〕。快速老化鼠给予银杏滴丸干预后, 其SOD活性也明显增加。免疫组化结果显示, SOD蛋白在肝细胞浆内表达较对照组明显增加, 和SOD基因表达上调相一致, 提示银杏滴丸通过可能某种途径调控SOD基因的表达, 使SODmRNA表达增加, 进而SOD蛋白翻译量增加, 表现为SOD活性较对照明显升高, 使与衰老密切相关的活性氧自由基减少, 从而发挥抗氧化作用和延缓衰老功能。银杏滴丸影响SOD基因表达的机制还有待进一步研究。此外, 本研究采用快速老化鼠(SAM)是一近交系小鼠群, 其特征为出现快速老化征候, 高龄期频繁出现在人类老年常见的与老化相关的病态^〔7〕, 其寿命仅为正常小鼠的1/2左右。YokozawaT等对SAM鼠研究中也发现, 其衰老过程中出现抗氧化能力下降, 脂质过氧化产物的蓄积^〔8〕。本试验选取了SAM P/8系小鼠, 研究银杏滴丸对其抗氧化作用的重要酶类SOD基因、蛋白水平的表达和其活性的影响获得满意结果, 并节省了人力物力。因此, 快速老化鼠可以作为抗氧化保健品功能学评价, 是开发延缓衰老食品、药物、保健品抗衰老研究的良好动物模型。